Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Исследование испражнений

Глава III. Диагностика гельминтозов и методы гельминтологических исследований

Необходимо обследовать на гельминтозы всех больных, обращающихся за медицинской помощью, и особенно больных, обращающихся к педиатру, терапевту и невропатологу с жалобами на явления со стороны желудочно-кишечного тракта, нервной системы и с анемией. Если врач не всегда может применить лабораторные методы исследования, то опросить больного о выделении у него гельминтов обязан каждый медицинский работник, оказывающий помощь в амбулатории или стационаре.

При наличии приведенных в соответствующих главах клинических показаний следует уточнить диагноз при помощи лабораторных методов исследования на гельминтозы.

В связи с преобладанием кишечных гельминтозов наибольшее практическое значение имеет исследование испражнений.

Методы исследования испражнений на гельминтозы

Испражнения доставляются в лабораторию в чистой стеклянной посуде (около четверти стакана испражнений, взятых из разных мест одной порции); при плановом обследовании допускается доставка испражнений в лабораторию в спичечных или лубочных коробочках.

Для контроля дегельминтизации доставляется (по назначению врача) вся порция испражнений, собранная после приема противоглистного средства и слабительного (в больших закрытых стеклянных банках, ведрах).

Микроскопическое исследование испражнений является основным при диагностике кишечных гельминтозов; ему всегда должен предшествовать общий макроскопический осмотр фекалий для обнаружения члеников крупных цестод, остриц, аскарид и др.

Испражнения должны быть свежими или консервированными (в 5% растворе формалина), так как высыхание резко изменяет структуру яиц. Кроме того, при стоянии фекалий происходит быстрое развитие яиц некоторых гельминтов (например, анкилостом), что затрудняет диагностику.

Согласно инструкции Министерства здравоохранения СССР, необходимо исследовать испражнения одновременно по методу Фюллеборна и нативного мазка.

Нативный мазок

Нативный мазок: небольшой кусочек фекалий (с горошину), взятый спичкой, стеклянной или деревянной палочкой из разных мест доставленной порции, тщательно растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина или в физиологическом растворе, или в воде. Накрывают покровным стеклом, слегка надавливая последнее (препаровальной иглой). Мазок должен быть тонким, прозрачным и равномерным. Он применяется лишь как дополнение к другим методам, дающим обогащение препарата. Просматривать следует не менее двух препаратов.

С целью обнаружения личинок гельминтов (а также яиц их) нативный мазок делается следующим образом (по Шульману): 2-3 г фекалий тщательно размешивают «закручиванием» стеклянной палочкой в эмульсию с пятикратным количеством чистой воды или физиологического раствора. Во время размешивания личинки скопляются у стеклянной палочки, поэтому тотчас после окончания размешивания каплю эмульсии быстро переносят стеклянной палочкой на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют. С. Д. Любченко (1936) доказала, что метод закручивания является более эффективным, чем метод мазка, особенно в отношении яиц аскарид. На основании работы С. Д. Любченко мы считаем целесообразным заменить метод мазка методом закручивания.

Метод Фюллеборна

Метод Фюллеборна: 5-10 г фекалий, взятых из разных мест, помещают в баночку емкостью в 50-100 мл и тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли (400 г этой соли растворяют в 1 л воды, нагревают до кипения и фильтруют через слой ваты или марли; раствор употребляется холодный: удельный вес 1,2). Раствор приливают постепенно, пока не получится равномерная суспензия, причем общее количество приливаемого раствора должно быть приблизительно в 20 раз больше количества фекалий. Для перемешивания фекалий Фюллеборн рекомендовал употреблять чайные стаканы, но удобнее готовить суспензию в баночках для мази емкостью в 50-100 мл, используя по две баночки на каждый анализ (или в стаканчиках емкостью в 100 мл).

Тотчас после приготовления суспензии с поверхности ее удаляют шпателем, металлическим совочком или кусочком чистой бумаги всплывшие на поверхность крупные частицы (растительные образования, непереваренные остатки пищи и пр), после чего смесь оставляют стоять на 1-1,5 часа. По истечении этого времени с поверхности смеси снимают всю пленку прикосновением проволочной или платиновой петли (плашмя) диаметром не больше 1 см, согнутой под прямым углом; пленку стряхивают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Под каждое покровное стекло (18х18 мм) помещают 3-4 капли. Всего следует приготовить не менее 4 препаратов (на каждый препарат - одно покровное стекло). Петлю прокаливают на огне и промывают водой после каждого анализа.

По методу Фюллеборна быстро и легко обнаруживаются яйца всех нематод (за исключением неоплодотворенных яиц аскарид) и яйца карликового цепня.

Метод Бермана применяется для исследования испражнений на личинки гельминтов (при стронгилоидозе). Этот метод заключается в следующем: 5 г фекалий на металлической сетке (для этих целей удобна цедилка для молока) помещают на стеклянную воронку, прикрепленную к штативу. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом.

Сетку с калом приподнимают и в воронку наливают нагретую приблизительно до 50° воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом была погружена в воду. Личинки активно переходят в воду и скопляются в нижней части резиновой трубки. Через 2-4 часа открывают зажим и жидкость спускают в одну или две центрифужные пробирки.

После центрифугирования в течение 1-2 минут верхнюю часть жидкости быстро сливают, а осадок наносят каплями на предметные стекла и исследуют под покровными стеклами или распределяют тонким слоем на 2-3 больших стекла и тогда исследуют без покровных стекол.

Метод Бермана применяется также и для исследования почвы на наличие личинок анкилостом.

Метод Столла

Метод Столла применяется для определения интенсивности инвазии. В специальную стеклянную колбочку наливают децинормальный раствор едкого натра до метки 56 см 3 , а затем прибавляют испражнения до тех на пор, пока уровень жидкости не достигнет 60 см 3 , т. е. 4 см 3 . После взбалтывания со стеклянными бусами берут для исследования 0,075 мл смеси и исследуют под одним-двумя обычными покровными стеклами. Полученную сумму умножают на 200, чтобы получить количество яиц, содержащихся в 1 см 3 испражнений.

Исследование дуоденального содержимого

Дуоденальный сок и пузырную желчь, полученные обычным путем при помощи зондирования (а пузырную желчь и после рефлекса с желчного пузыря), тщательно смешивают с равным объемом этилового эфира; смесь центрифугируют, после чего осадок исследуют под микроскопом. Помимо осадка, микроскопическому исследованию обязательно подвергаются плавающие в жидкости хлопья, в которых могут находиться яйца гельминтов. При исследование на яйца гельминтов желудочного сока и рвотных масс можно пользоваться этой же методикой.

Исследование дуоденального сока и содержимого желудка необходимо производить при подозрении на глистные заболевания печени, желчного пузыря (описторхоз, фасциолез, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишки (стронгилоидоз).

Исследование мокроты

Мокроту растирают по стеклянной пластинке, плотно накрывают другой стеклянной пластинкой и рассматривают невооруженным глазом на светлом и черном фоне, а также под лупой при проходящем свете. Отдельные кусочки мокроты («ржавые» скопления, обрывки тканей и пр.) наносят тонким слоем на предметное стекло, плотно накрывают его покровным и исследуют при малом и большом увеличении микроскопа.

а) Для диагносцирования цистицеркоза кожи, подкожной клетчатки или мышц, асептически вырезанный кусочек соответствующей ткани исследуют сначала не вооруженным глазом. Участки тканей раздвигают при помощи препаровальных игл с целью обнаружения видимого простым глазом пузырька - цистицерка (фото А); длина его 6-20 мм, ширина 5-10 мм. При обнаружении пузырька, подозрительного на цистицерк, он раздавливается между двумя предметными стеклами и рассматривается под микроскопом. Цистицерк (Cistycercus cellulosae) определяется по наличию сколекса с четырьмя присосками и венчиком крючьев (фото Б).

Фото. А — цистицерки с вывернутыми наружу сколексами; Б — Головка свинного цепня.

б) Для диагносцирования трихинеллеза асептически вырезанный кусочек мышцы (двуглавой или икроножной) тщательно измельчают в 50% растворе глицерина на тончайшие волоконца с помощью препаровальных игл. Измельченные мышцы сдавливаются между двумя предметными стеклами и исследуются при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения. Исследование мышц на трихинеллез рекомендуется производить не ранее чем на 8-й день заболевания. Личинки трихинелл находятся в мышцах в свернутом спиралью положении: они заключены в лимонообразные капсулы.

Фото. А —Личинки трихинелл в мышцах; Б — Обызвествленные капсулы трихинелл.

Рентгеноскопия

Наиболее часто рентгеноскопия применяется для диагносцирования эхинококкоза и реже - цистицеркоза. Цистицерки обнаруживаются при рентгеноскопии только после обызвествления (в случаях длительного заболевания). За последние годы рентгеноскопия применяется и для диагносцирования аскаридоза как в ранней личиночной стадии, так отчасти и в кишечной стадии.

В период миграции личинок аскарид (и анкилостомид) в легких выявляются нестойкие, иногда множественные воспалительные очаги; одновременно в крови появляется значительная эозинофилия.

Половозрелые аскариды хорошо видны при рентгеноскопии кишечника пораженных лиц. Этот метод, несмотря на его сложность и громоздкость, должен быть использован как дополнительный для диагностики аскаридоза в случаях с отрицательным копрологическим анализом. По данным Е. С. Геселевич, из 180 больных аскаридозом, выявленных при рентгеноскопии, у 54 в кале не было обнаружено яиц аскарид (смотри ).

7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

7.7.1. Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.

Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.

Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.

Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Размеры	Характерные признаки
A. duodenale	Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм	Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой
N. americanus	Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм	Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен
S. stercoralis	Длина тела около 500 мкм	Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный
Trichostrongylus sp.	Длина тела около 750 мкм	Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки

7.7.2. Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов

Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.

Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:

1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.

2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).

3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

7.7.3. Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов

Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.

Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.

При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.

Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.

7.7.4. Метод биологической пробы

Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).

Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.

В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.

Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.

Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.

Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Медицинское значение имеют три группы гельминтов-нематоды (круглые черви), цестоды (ленточные черви) и трематоды (сосальщики).

Для видовой идентификации яиц гельминтов используются следующие признаки.

1. Размеры . Измеряют длину и ширину яиц, которые обычно имеют определенную у каждого вида величину.

2. Форма . Для каждого вида характерна своя особая форма яиц.

3. Стадия развития при выделении во внешнюю среду . У одних Видов яйца состоят из одной клетки; у других в яйце может быть несколько клеток; у третьих яйца обычно эмбрионированы (т.е. они содержат личинки) при выделении с фекалиями во внешнюю среду. Иногда, если пробы фекалий исследуют через несколько часов или спустя 1-2 дня после дефекации, яйца гельминтов развиваются до более взрослых стадий. В идеале на анализ следует принимать только свежие пробы фекалий.

4. Толщина оболочки яйца. Яйца некоторых видов, например аскарид, имеют толстую оболочку; у других видов гельминтов, например у анкилостомид, оболочка яиц тонкая.

6. Наличие морфологических особенностей , таких, как крышки, шипы, пробки, крючочки или фестончатая наружная оболочка.

При обнаружении яйца гельминта или похожего на него объекта следует тщательно оценить все перечисленные выше признаки, чтобы установить видовой диагноз.

Для того чтобы установить видовую принадлежность яиц гельминтов, необходимо определить их размер, форму, стадию развития, толщину оболочки, цвет и наличие морфологических особенностей, таких, как крышечки, шипы, пробки, крючочки и бугристая наружная оболочка.

Для установления видового диагноза используют специальные определители и схематические изображения яиц гельминтов.

Рис. 34.2. Относительная величина, форма и структура яиц гельминтов.

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПРАЖНЕНИЙ.

Гельминтологические исследования проводятся с целью диагностики гельминтозов путем обнаружения в патологическом материале яиц, личинок, взрослых гельминтов или их фрагментов. Поскольку большинство гельминтов в половозрелой стадии развития находится в желудочно-кишечном тракте или в сообщающихся с ним органах, чаще всего применяются макро- и микрогельминтоскопические методы исследования фекалий (не более суточной давности).

С целью повышения достоверности обследования анализы должны быть повторены несколько раз ежедневно с промежутком 1-3 дня.

1.1. МАКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИСПРАЖНЕНИЙ

Метод отстаивания . Суточную порцию фекалий тщательно промывают водой, пока вода над осадком не станет прозрачной. Слив верхний слой, переносят осадок в чашку Петри и на темном фоне просматривают его под лупой или невооруженным глазом.

Метод отсеивания. Перемешанные с водой фекалии помещают на систему сит специального прибора. После промывания водопроводной водой сита переворачивают и, смыв содержимое в чашки Петри, просматривают невооруженным глазом или под лупой.

1.2. МИКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используют гельминтоовоскопические и гельминтоларвоскопические методы с целью обнаружения яиц гельминтов и их личинок.

1.2.1. ГЕЛЬМИНТООВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

При использовании гельминтоовоскопических методов обнаружения гельминтов вначале готовят двоякого рода мазки – нативный и толстый .

Þ Нативный мазок. Небольшое количество фекалий растирают на предметном стекле в капле 50%-ного раствора глицерина или кипяченой воды. Крупные частицы осторожно удаляют, смесь накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (просматривают два мазка).

Делая нативный мазок, следует знать, что при слабых инвазиях в нем редко обнаруживаются яйца гельминтов.

Þ Толстый мазок с целлофаном по Като. Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Подготовленный толстый мазок фекалий покрывают кусочком целлофана, смоченного смесью глицерин-фенол влажного целлофана. Препарат исследуют через 30–60 мин, когда он слегка подсохнет и просветлится, вследствие чего яйца гельминтов легко обнаружатся под малым увеличением микроскопа.

В большом мазке хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже – прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден.

Þ Методы обогащения

Среди методов обогащения используют методы флотации (всплывания) и седиментации (осаждения).

А). Методы флотации основаны на применении насыщенных растворов различных химических веществ, в которых яйца всплывают благодаря разнице удельного веса.

Метод всплывания по Фюллеборну основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия (удельный вес 1,18), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка. Достоинствами является доступность и дешевизна. Данный метод хорошо выявляет яйца нематод и карликового цепня.

Однако яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Поэтому требуется обязательно исследовать не только поверхностную пленку, но и осадок, что усложняет метод. К недостаткам относится и замедленное всплывание яиц: яйца карликового цепня всплывают через 15-20 мин, аскарид – через 1,5-2 часа, власоглава – через 2-3 часа.

Метод Е.В.Калантарян также метод обогащения, но более эффективен и проще. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностно пленке, исследование осадка не требуются.

Недостаток метода – дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке.

Б). Метод осаждения (седиментации) яиц гельминтов основаны на использовании химических веществ, растворяющих жиры и белки фекалий.

Метод П.П.Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод.

Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метода Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуются методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.

1.2.2. ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (выявление личинок)

Метод закручивания по Е.С.Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоидов . Исследуют только свежевыделенные фекалии, которые размешивают палочкой в 5-кратном количестве воды. Через 20-30 ск после начала размешивания палочку быстро вынимают, образовавшуюся на ее конце каплю жидкости переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Берманна основан на способности личинок гельминтов мигрировать по направлению к теплу и служит для их выявления в фекалиях, в первую очередь при подозрении на стронгилоидоз.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДРУГИХ ЭКСКРЕТОВ И СЕКРЕТОВ

В дуоденальном содержимом микроскопируют имеющиеся в нем хлопья и плотные включения, а затем, разлив его по пробиркам, добавляют равный объем серного эфира, центрифугируют и исследуют осадок.

В рвотных массах изредка обнаруживаются гельминты или их фрагменты (например, при прорыве нагноившейся эхинококковой кисты из легкого в бронхи с рвотой выделяется светлая водянистая или гнойная жидкость). Диагноз ставится на основании обнаружения обрывков кутикулярной оболочки, сколексов и крючьев эхинококка.

Исследование мочи.

Мочеполовой шистосомоз диагностируют путем выявления яиц и мирацидиев. Яйца возбудителя мочеполового шистосомоза (Schistosoma haemotobium) крупные и достигают в длину 120-150 мкм, они имеют терминальный шип на одном конце. Внутри яйца можно увидеть зародыш (мирацидий). Иногда возникает необходимость установить, являются ли обнаруженные яйца жизнеспособными. Это можно определить, если препарат свежий и к нему не добавлялись консерванты. При хронической форме шистосомоза у больных к концу мочеиспускания выделяется кровь, но яйца в моче находят редко, вследствие чего рекомендуется прибегать к биопсии мочевого пузыря.

Яйца парагонимуса, обитающего преимущественно в легких, в случае локализации в почке, мочеточниках, стенках мочевого пузыря попадают в мочу. В хилезной моче выявляются микрофилярии.

Исследование мокроты.

В мокро те могут находиться яйца парагонимусов, шистосом, личинки мигрирующих нематод, фрагменты эхинококкового пузыря. При некоторых гельминтозах в мокроте наблюдаются характерные изменения. При парагонимозе , например, в мокроте можно обнаружить скопления яиц в виде желтоватых комочков.

Гельминтологические методы исследований. Методы диагностики гельминтозов разделяют на прямые, основанные на непосредственном выявлении самих гельминтов или их фрагментов, а также личинок и яиц гельминтов (методы исследования фекалий, мочи, желчи и дуоденального содержимого, мокроты, крови и тканей, материала, полученного при соскобе из перианальной области и подногтевых пространств), и косвенные, с помощью которых выявляют вторичные изменения, возникающие в организме человека в результате жизнедеятельности гельминтов (исследования морфологического состава крови, иммунологические методы диагностики гельминтозов, рентгенологические исследования и т.д.). Из прямых методов наиболее распространены копрологические, которые делятся на макро- и микрогельминтоскопические. В отдельных случаях используют специальные методы.

Макрогельмитоскопические методы исследования направлены на поиски гельминтов или их фрагментов (сколексов, члеников, частей стробилы цестод). Их применяют для диагностики тех гельминтозов, при которых яйца не выделяются с экскрементами больного или выделяются в небольшом количестве и не всегда (например, при энтеробиозе в фекалиях обнаруживают острицы, при тениидозах — членики). Для обнаружения в фекалиях остриц или члеников цестод проводят просмотр фекалий невооруженным глазом. Для дифференциальной диагностики тениидозов рекомендуется просмотр разжиженных водой фекалий отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или в чашках Петри на темном фоне. Крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают под лупой между двумя предметными стеклами. Если же по клиническим показаниям предполагают обнаружение мелких гельминтов или головок цестод после лечения, то подозрительные частицы рассматривают под лупой в капле глицерина, а в случае необходимости и под микроскопом.

Микрогельминтоскопические методы исследования (качественные) направлены на выявление яиц и личинок гельминтов. Применяют метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като. Смесь Като состоит из 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% раствора фенола. Пластинки по Като (гидрофильный целлофан разрезают на части размером 20-40 мм) погружают на 24 ч в смесь Като так, чтобы они прилегали друг к другу (3—5 мл раствора Като на 100 пластинок). 100 мг фекалий наносят на предметное стекло, накрывают целлофановой покровной пластинкой по Като и придавливают так, чтобы фекалии размазались по предметному стеклу в пределах целлофановой пластинки.

Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 40—50 мин, после чего просматривают под микроскопом. В жаркое время года во избежание высыхания препарата на пластинку приготовленного препарата кладут влажную губку. Для полного выявления гельминтов всех видов метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като необходимо использовать в сочетании с одним из методов обогащения. Наиболее распространенными из них являются метод Калантарян и метод Фюллеборна. Метод Калантарян: в склянках с широким горлом объемом 100 мл тщательно размешивают стеклянной палочкой 5 г фекалий, постепенно доливая насыщенный раствор нитрата натрия (1 кг азотнокислого натрия на 1 л воды при кипячении) до краев стакана. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют бумажным совочком. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло (солевой раствор добавляют до полного соприкосновения смеси с предметньм стеклом). Через 20—30 мин предметное стекло снимают и пленку просматривают под микроскопом. При отсутствии данной соли можно использовать насыщенный раствор поваренной соли по Фголлеборну (400 г соли в 1 л воды при кипячении).

В связи с тем, что яйца, имеющие большой удельный вес (неоплодотворенные яйца аскарид, яйца трематод и крупных цестод), не всплывают, помимо исследования поверхностного слоя жидкости, при использовании метода Фюллеборна необходимо просмотреть под микроскопом 2—4 препарата из осадка. Специальные лабораторные методы исследований на различные гельминтозы. Исследования на энтеробиоз. Обследование на энтеробиоз проводится после сна без предварительного подмывания перианальной области. Наиболее простым является обнаружение яиц остриц в перианальном соскобе с применением деревянного шпателя (спички). Соскабливание производят с поверхности перианальных складок деревянным шпателем (отточенной в виде шпателя спичкой), смоченным в 50% растворе глицерина или в 1% растворе гадрокарбоната натрия. Полученный материал тщательно счищают со шпателя краем предметного стекла на другое предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина и микроскопируют. При обследовании работников общественного питания удобнее исследовать материал из подногтевых пространств, используя смесь из равных количеств 50% водного раствора глицерина и раствора Люголя.

Более эффективен метод использования прозрачной полиэтиленовой ленты с липким слоем путем отпечатка с перианальных складок обследуемого. В лаборатории заранее нарезают полоски липкой ленты длиной 9 см и наклеивают липким слоем на предметные стекла так, чтобы один конец выступал за край стекла на 1 см. На липкую сторону выступающего конца ленты наклеивают белую бумагу, на которой записывают порядковый номер исследования. При проведении обследования захватывают свободный конец ленты пальцами, отклеивают ее от предметного стекла до второго конца и прикладывают липким слоем к перианальным складкам. Для обеспечения полного контакта с кожей полоска приглаживается деревянным шпателем. Затем ленту отделяют от кожи и наклеивают липким слоем к предметному стеклу. Ленту хорошо разглаживают для устранения пузырьков воздуха и других неровностей.

Препарат исследуют под микроскопом. Исследования на тениидозы. Основным методом диагностики тениаринхоза служит опрос с целью установления выделения члеников тениид с фекалиями. Можно использовать также методы перианального соскоба и метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като. Диагностика тениоза затруднительна, т.к. членики свиного цепня активно не выделяются. При подозрении на тениоз следует провести диагностическую дегельминтизацию малыми дозами мужского папоротника или семенами тыквы. Исследования на стронгилоидоз. Диагноз стронгилоидоза ставят при нахождении в фекалиях личинок гельминта. Наиболее эффективен метод Берманна. На узкий конец стеклянной воронки надевают резиновую трубку с зажимом и укрепляют ее на металлическом штативе. В воронку помещают металлическую сетку, на которой находится 5—10 г фекалий. Приподняв сетку, заполняют воронку подогретой до 40—45° водой так, чтобы нижняя часть сетки с фекалиями была погружена в воду. Личинки из фекалий активно переходят в теплую воду и скапливаются в нижней части резиновой трубки, надетой на воронку. Через 4 ч зажим на трубке открывают и спускают жидкость в 1—2 центрифужные пробирки. После центрифугирования в течение 2—3 мин надосадочную жидкость быстро сливают, а осадок переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.

Наиболее простой метод выявления личинок стронгилоид в фекалиях, который можно использовать при массовых обследованиях в очагах инвазии, предложен Е.С. Шульманом, В.Г. Супрягой, Г.Л. Плющевой и др. Фекалии (5 г) собирают в стаканчик и заливают обычной (водопроводной) водой комнатной температуры (10—15 мл). Через 20 мин воду сливают в чашку Петри и исследуют под микроскопом. При подозрении на строигилоидоз в случае отрицательного результата однократного исследования необходимо проводить повторные анализы с промежутками в 5—7 дней, сочетая их с исследованиями дуоденального содержимого и желчи. Дуоденальное содержимое и желчь (порции А, В, С) получают обычным путем с помощью зондирования. Из исследуемой жидкости сначала выбирают и просматривают под микроскопом плавающие в ней хлопья, а затем смешивают ее с равным количеством этилового эфира. Смесь тщательно взбалтывают и центрифугируют 10—15 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а весь осадок исследуют под микроскопом.

При исследовании дуоденального содержимого можно выявить и гельминтозы с локализацией возбудителя в печени, желчном пузыре, двенадцатиперстной кишке (например, при описторхозе, фасциолезе, клонорхозе, дикроцелиозе, трихостронгилидозе). Исследования на анкилостомидозы. Для диагностики анкилостомидозов используют методы обогащения по Калантарян или Фюллеборну. Для дифференциальной диагностики анкилостомоза и некатороза рекомендуется метод культивирования личинок по Хараде — Мори в модификации Маруашвили с соавторами. На фильтровальную бумагу размером 16?3,5 наносят фекалии тонким слоем таким образом, чтобы края бумаги оставались свободными. Бумагу с фекалиями помещают в банку объемом 0,8 л, заполняют водой так, чтобы нижний край бумаги, свободный от фекалий, был погружен в воду. Банку на 5—6 дней помещают в термостат при t° 28°. Филяриевидные личинки, развившиеся за это время из яиц, спускаются по фильтровальной бумаге и оседают на дне банки. По окончании инкубации фильтровальную бумагу извлекают из банки, а жидкость исследуют под лупой. В сомнительных случаях жидкость центрифугируют, а осадок исследуют под микроскопом. Исследования на легочные гельминтозы.

Для обнаружения яиц гельминтов в фекалиях используют метод последовательных промываний. Небольшую порцию фекалий смешивают с водой в чашке Петри и оставляют до осаждения взвешенных частиц. Надосадочный слой сливают и заменяют чистой водой. Процедуру повторяют несколько раз до получения прозрачной надосадочной жидкости, отмытый осадок исследуют под микроскопом. Используют несколько проб фекалий. Исследования на трихинеллез (выявление личинок трихинелл). При компрессионном методе кусочек двуглавой или икроножной мышцы (вблизи сухожилий), взятой хирургическим путем с соблюдением асептики, расщепляют препаровальными иглами на отдельные тонкие волоконца, сдавливают их между двумя предметными стеклами в капле 50% раствора глицерина так, чтобы препарат был тонким и прозрачным. Под микроскопом с затемненным полем зрения хорошо видны личинки трихинелл. Эффективно исследование нескольких кусочков мышц в компрессориумах, используемых в ветеринарно-санитарной практике, или в специальных трихинеллоскопах.

Метод переваривания Бечмена: 1 г измельченных мышц заливают 60 мл искусственного желудочного сока (0,5 г пепсина; 0,7 мл концентрированной соляной кислоты; 100 мл воды) и выдерживают 18 ч в термостате при t° 37°, верхний слой жидкости сливают, к осадку добавляют теплую воду (37—45°) и выливают в аппарат Берманна. Через час жидкость спускают в пробирку, центрифугируют и исследуют осадок. Если личинки заключены в обызвествленные капсулы, их предварительно декальцинируют в растворе соляной, азотной или серной кислоты. Биопроба: кусочки исследуемых мышц скармливают белым мышам или крысам, у которых через 2—3 дня можно обнаружить половозрелых трихинелл в дуоденальном содержимом, а через 2—3 нед. — личинок в мышцах диафрагмы и языка. При применении гельминтологических срезов кусочки мышц фиксируют в жидкости Буэна, Ценкера или др. Обычным способом готовят срезы на микротоме и окрашивают их гематоксилином Делафильда.

Исследования на цистицеркоз. Кусочек мышечной, соединительной ткани, подкожных узелков и пр. осматривают невооруженным глазом, осторожно выделяют цистицерк (беловатый полупрозрачный пузырек размером 1—2 см), раздавливают его между двумя предметными стеклами в капле глицерина и исследуют под микроскопом. Для определения жизнеспособности выделенных из тканей цистицерков их выдерживают в 50% растворе желчи на изотоническом растворе хлорида натрия в термостаге при t° 37°; через 10—60 мин головка жизнеспособного цистицерка выворачивается наружу Обызвествленных цистицерков предварительно декальцинируют 4% раствором азотной кислоты в течение часа. Исследования на шистосомозы. Исследование мочи: не менее 5 мл мочи, собранной в середине дня, помещают в конический стакан на 30 мин, затем сливают.

Пипеткой наносят на предметное стекло каплю из осадка мочи, готовят мазок и исследуют под малым увеличением микроскопа. Добавление к осадку 1—2 капель 50% раствора глицерина значительно просветляет осадок и облегчает его исследование. Можно использовать центрифугирование (особенно при низкой интенсивности инвазии). Пробу свежей мочи помещают в 2 центрифужные пробирки по 10 мл и центрифугируют при 1000—1500 об/мин в течение 5—10 мин. Из осадка готовят препараты и исследуют под малым увеличением микроскопа. К препаратам можно добавить 1—2 капли красителя (раствора Люголя или 1—2% водного раствора метиленового синего). Это создает цветной фон, что облегчает выявление яиц шистосом. При исследовании фекалий методом их осаждения — в коническом стакане емкостью 200 мл смешивают 1 г фекалий с 1—2 мл растворителя (50% раствора глицерина и изотонический раствор хлорида натрия в соотношении 1:1). Разводят содержимое растворителем до объема сосуда и дают отстояться и течение 20—30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом.

Для получения лучшей концентрации осадок нужно ресуспендировать в растворителе до получения взвеси и дать ей отстояться в коническом стакане в течение 10 мин. Осадок с придонного слоя забирают пастеровской пипеткой, помещают 2 капли на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. При использовании метода осаждения по Ритчи в сосуде смешивают примерно 2 г фекалий с 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и помещают в центрифужную пробирку емкостью 15 мл. Пробирку закрывают пробкой и встряхивают в течение 30 с. Пробку удаляют, а содержимое центрифугируют в течение 2 мин при 2000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, добавляют к осадку 10 мл 10%, раствора формалина, тщательно смешивают и дают смеси отстояться 5 мин. Добавляют в нее 3—4 мл эфира, закрывают пробирку пробкой, встряхивают, удаляют пробку и центрифугируют 2 мин.

Аппликатором удаляют детрит, сливают надосадочную смесь формалина с эфиром, осадок с придонного слоя забирают пастеровской пипеткой и исследуют под малым увеличением микроскопа. Количественные методы диагностики гельминтозов применяют при необходимости установить интенсивность инвазии. Эти методы позволяют судить об эффективности дегельминтизации, давать оценку действия различных антигельминтных препаратов, а также могут служить контролем проводимых массовых лечебно-профилактических мероприятий. Работа с фекалиями в лаборатории. Для исследования берут фекалии из разных мест порциями в стеклянную или пластмассовую посуду, парафиновые стаканчики, на которые наклеивают этикетку с указанием фамилии, имени, отчества, возраста и адреса обследуемого. Количество фекалий должно быть не менее 1/4 стакана, т.к. небольшие порции испражнений быстро высыхают и яйца в них деформируются. Кроме того, может возникнуть необходимость в повторном исследовании другими методами. Фекалии для исследований следует доставлять в лабораторию в течение 1 сут. после дефекации, а при исследовании на стронгилоидоз сразу после дефекации.

В случае необходимости длительного хранения материала и для транспортировки в качестве консервантов используют жидкость Барбагалло (в 1000 мл воды растворяют 8,5 г поваренной соли и 30 мл формалина) или жидкость Шуренковой (1900 мл 0,2% водного раствора нитрата натрия, 250 мл крепкого раствора Люголя, 300 мл неразведенного формалина, 25 мл глицерина); либо растворов стирального порошка: 1% раствор Лотоса или 1,5% раствор Экстры (в весовом соотношении фекалий и раствора стирального порошка 1:5). После проведения анализов посуду дезинфицируют: кипятят или выдерживают в течение 5 ч в 5% растворах фенола, лизола, 2% растворе крезола. При регистрации результатов анализов названия гельминтов обозначают по современной номенклатуре (латинское название). Иммунологические метолы диагностики наиболее эффективны при гельминтозах, возбудители которых обитают непосредственно в тканях или в ранней фазе своего развития мигрируют по кровеносному руслу и внутренним органам хозяина.

Используют аллергические реакции (кожную и внутрикожную пробу) и иммунологические реакции: реакцию кольцепреципитации (РКП) для диагностики трихинеллеза; латекс-агглютинации (РЛА) с диагностикумом длительного срока хранения для диагностики эхинококкоза и альвеококкоза; непрямой гемагглютинации (РНГА) для диагностики эхинококкоза, цистицеркоза мозга и преиматинальной фазы аскаридоза; иммунофлюоресцирующих антител (РИФА) для диагностики цистицерков и трихинеллеза; микропреципитации на личинках (РМПЛ) для диагностики нематодозов (преимагинальной фазы аскаридоза; анкилостомидозов, трихинеллеза); иммуноферментную реакцию (ИФР) для диагностики эхинококкоза, альвеококкоза, описторхоза, трихинеллеза; реакцию связывания комплемента (РСК) для диагностики трихинеллеза и цистицеркоза. Применяют также реакцию иммуно-электрофореза (РИЭФ) и двойной диффузии в геле (РДДГ).

Библиогр.: Березанцев Ю.А. и Автушенко Е.Г. Гельминтологическая копрологическая диагностика, Л., 1976; Лейкина Е.С. Важнейшие гельминтозы человека, с. 335, М., 1967; Унифицированные методы клинических лабораторных исследований, под ред. В.В Меньшикова, вып. 4, с. 275, М., 1972.