Метод получения генно инженерного интерферона. Биосинтез соматотропина и других гормонов человека. Получение интерферонов. Плесневые грибы и сельское хозяйство

В 1957 г. ученые обнаружили, что клетки, зараженные вирусом, вырабатывают особое вещество, угнетающее размножение как гомологичных, так и гетерологичных вирусов, которое они назвали интерфероном. Если иммунная система обеспечивает белковый гомеостаз и через него устраняет чужеродную генетическую информацию, то система интерферона непосредственно воздействует на чужеродную генетическую информацию, устраняя ее из организма на клеточном уровне, и тем самым обеспечивает нуклеиновый гомеостаз. Система интерферона тесно взаимодействует с иммунной системой.
Интерфероны закодированы в генетическом аппарате клетки. Гены для человеческого фибробластного интерферона располагаются во 2-й, 9-й и длинном плече 5-й хромосомы, а ген, регулирующий транскрипцию - в коротком плече той же хромосомы. Ген, детерминирующий восприимчивость к действию интерферона, локализован в 21-й хромосоме. Ген для α-интерферона располагается в 9-й хромосоме, для γ-интерферона - в 11-й хромосоме.
Система интерферона не имеет центрального органа, так как способностью вырабатывать интерферон обладают все клетки организма позвоночных животных, хотя наиболее активно вырабатывают его клетки белой крови.
Интерферон спонтанно не продуцируется интактными клетками и для образования его нужны индукторы, каковыми могут быть вирусы, бактериальные токсины, экстракты из бактерий и грибов, фитогемагглютинины, синтетические вещества - поликарбоксилаты, полисульфаты, декстраны, но наиболее эффективными индукторами интерферона являются двунитчатые РНК: двунитчатые вирусные РНК и двунитчатые синтетические сополимеры рибонуклеотидов (поли-ГЦ, поли-ИЦ) и др. Индукция интерферона происходит вследствие дерепрессии его генов.
Типы интерферонов. Известны три типа интерферонов человека: α-интерферон, или лейкоцитарный интерферон, который продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами; β-интерферон, или фибробластный интерферон, который продуцируется фибробластами, обработанными вирусами и другими агентами. Оба эти интерферона принадлежат к типу 1. Более сильный γ-интерферон, или иммунный интерферон, принадлежит к типу 2. Имеется несколько подтипов α-интерферона, и общее число их у человека доходит до 25. Сравнительная характеристика интерферонов человека приведена в таблице. Активность интерферонов измеряется в международных единицах (ME). Одна единица соответствует количеству интерферона, которое ингибирует репродукцию вируса на 50 %.
При индукции интерферонов синтезируется два и более его типов. Так, при индукции интерферона на лимфобластах образуется 87 % лейкоцитарного и 13 % фибробластного интерферона, при индукции интерферона на фибробластах имеют место обратные соотношения. Между тремя типами интерферонов могут существовать синергические взаимодействия.

Таблица 2
Сравнительная характеристика интерферонов человека

Свойства интерферонов. Интерфероны обладают видотканевой специфичностью. Это означает, что интерферон человека действует только в организме человека, но неактивен в организме других биологических видов. Конечно, барьеры видовой специфичности не абсолютны: интерферон человека проявляет некоторую активность в тканях человекообразных обезьян, а куриный интерферон в организме близких видов семейства куриных. Однако активность интерферона в гетерогенных организмах резко снижается.
Поэтому можно заключить, что интерфероны, появившиеся у позвоночных, эволюционировали вместе с хозяевами. Интерферон является относительно устойчивым белком и хорошо переносит кислую среду (рН 2,2), что используется для выделения его и очистки. Антигенные свойства интерферонов мало выражены, в связи с чем, антитела к нему удается получить лишь после многократных иммунизаций.
Интерфероны не обладают специфичностью в отношении вирусов и действуют угнетающе на репродукцию различных вирусов, хотя разные вирусы обладают неодинаковой чувствительностью к интерферону. Чувствительность к нему обычно совпадает с индуцирующей активностью к интерферону. Наиболее часто применяемыми индукторами интерферона и тест-вирусами для его титрования являются рабдовирусы (вирус везикулярного стоматита), парамиксовирусы, тогавирусы. Продукция интерферона зависит также от характера применяемых клеток. Существуют клетки, дефектные по нескольким генам интерферона.
Интерфероны оказывают антивирусное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и многие другие действия. Наиболее изучено их антивирусное действие, и именно на вирусных моделях выяснены биологические и другие свойства интерферонов.
Интерферон оказывает противоопухолевое действие при парентеральном введении в больших дозах, связанное с подавлением им цитопролиферативной активности. Добавление интерферона к культуре нормальных клеток сопровождается уже через 2 ч угнетением в них синтеза ДНК. При вирусиндуцированных опухолях интерферон угнетает репродукцию онковирусов и одновременно подавляет цитопролиферативную активность.
Интерферон является регулятором различных механизмов иммунного ответа, оказывая стимулирующее или угнетающее действие на иммунные реакции.
Механизм действия интерферона. Интерферон связывается с клеточными рецепторами, находящимися на плазматической мембране, что служит сигналом для дерепрессии соответствующих генов. В результате индуцируется синтез особой протеинкиназы PKs, которая присутствует в следовых количествах во всех клетках млекопитающих и активируется низкими концентрациями двунитчатой РНК, а в зараженных вирусами клетках - вирусными репликативными комплексами.
Протеинкиназа фосфорилирует а-субъединицу инициирующего фактора трансляции eIF-2, и фосфорилирование блокирует активность инициирующего фактора. В результате иРНК, связанная с инициирующим комплексом, не может связаться с большой рибосомальной субъединицей, и поэтому ее трансляция блокируется. Инициирующий фактор eIF-2 в одинаковой степени необходим для трансляции как клеточных, так и вирусных иРНК, однако преимущественно блокируется трансляция вирусных иРНК, связанных с вирусными двунитчатыми РНК-структурами, в результате локальной активации протеинкиназы.
В обработанных интерфероном клетках индуцируется синтез фермента - синтетазы, которая катализирует 2,5-олигоадениловую кислоту, переключающую действие клеточных нуклеаз на разрушение вирусных иРНК. Таким образом, вирусные иРНК подвергаются разрушению нуклеазами. Блокирование интерфероном стадии инициации трансляции и разрушение иРНК обусловливают его универсальный механизм действия при инфекциях, вызванных вирусами с разным генетическим материалом.
Применение интерферонов. Интерфероны применяются для профилактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется дозой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях заболевания, применяется местно, например путем закапывания или введения с помощью ингалятора в верхние дыхательные пути в концентрациях до 3∙104-5∙104 ед 2-3 раза в день. При конъюнктивитах интерферон применяют в виде глазных капель. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных новообразованиях. При этих заболеваниях назначают более высокие концентрации. Препарат применяется парентерально - внутривенно и внутримышечно в дозе 105 ед на 1 кг массы тела. Более высокие дозы оказывают побочное действие (повышение температуры, головная боль, выпадение волос, ослабление зрения и т.д.). Интерферон может вызвать также лимфопению, задержку созревания макрофагов, у детей - тяжелые шоковые состояния, у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями - инфаркт миокарда. Очистка интерферона значительно снижает его токсичность и позволяет применять высокие концентрации. Очистка осуществляется с помощью аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител к интерферону.
Генноинженерный интерферон. Генноинженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения интерферона включает следующие этапы:
1) обработка лейкоцитарной массы индукторами интерферона;
2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК;
3) получение суммарных комплементарных ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы;
4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование;
5) отбор клонов, содержащих гены интерферона;
6) включение в плазмиду сильного промотора для успешной транскрипции гена;
7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка;
8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.
Получены высокоочищенные и концентрированые препараты интерферона, которые испытываются в клинике.
Человеческий лейкоцитарный интерферон, нативный и концентрированный, предназначен для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.
Лейкоцитарный интерферон - видоспецифический белок, синтезируемый лейкоцитами человека в ответ на воздействие вируса-интерфероногена. Интерферон не обладает избирательной противовирусной активностью и действует практически на все вирусы.
Для приготовления интерферона используют лейкоциты свежеполученной донорской крови. Под воздействием вируса - интерфероногена лейкоциты, находящиеся в культуральной среде, синтезируют интерферон. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, вирус инактивируют. Препарат является нативным интерфероном. Для получения концентрированного нативный интерферон дополнительно очищают методом хроматографического разделения на колонках с сефадексом.
Интерферон выпускают в сухом виде в ампулах. Нативный сухой интерферон представляет собой пористый порошок серовато-коричневого цвета, который легко растворяется в дистиллированной воде. Растворенный препарат имеет розовато-красный цвет с опалесценцией. Допускается слабый коричневый оттенок раствора. Концентрированный сухой препарат - пористый порошок серовато-белого цвета, также легко растворяющийся в дистиллированной воде. Раствор препарата имеет сероватый цвет с опалесценцией, допустим слабый желтовато-коричневый оттенок. Посторонние примеси содержаться не должны.
Человеческий лейкоцитарный интерферон выпускают вирусологически и бактериологически стерильным. Противовирусная активность нативного препарата должна быть не менее 32 единиц, концентрированного - 100 единиц. Активность определяется титрованием на первичной культуре клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита.
Противопоказаний к применению препарата нет. Интерферон нереактогенен, не вызывает побочных явлений.
Препарат хранят при температуре 4 °С. Срок годности 1 год. По истечению его может быть проведен переконтроль в институте, изготовившем данную серию препарата. При сохранении физических свойств и активности срок годности препарата может быть продлен еще на 3 месяца.

Интерфероны - гликопротеины, вырабатываемые клетками в ответ на вирусную инфекцию и другие стимулы. Бло­кируют репродукцию вируса в других клетках и участвуют во взаимодействии клеток иммунной системы. Различают две се­рологические группы интерферонов: I тип - ИФН-α и ИФН -β; II тип - ИФН-.γ Интерфероны I типа оказывают противовирус­ные и противоопухолевые эффекты, в то время как интерферон II типа регулирует специфический иммунный ответ и неспеци­фическую резистентность.

α- интерферон (лейкоцитарный) продуцируется лейкоцитами, обработанными вирусами и другими агентами. β-интерферон (фибробластный) продуцируется фибробластами, обработанными вирусами.

ИФН I типа, связываясь со здоровыми клетками, защищает их от вирусов. Антивирусное действие ИФН I типа может обуславливаться и тем, что он способен угне­тать клеточную пролиферацию, препятствуя синтезу аминокис­лот.

ИФН-γ продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Стимулирует активность Т- и В-лимфоцитов, моноци­тов/макрофагов и нейтрофилов. Индуцирует апоптоз активированных макрофагов, кератиноцитов, гепатоцитов, клеток костного мозга, эндотелиоцитов и подавляет апоптоз периферических моноцитов и герпес-инфицированных нейронов.

Генно-инженерный лейкоцитарный интерферон получают в прокариотических системах (кишечной палочке). Биотехнология получения лейкоцитарного интерферона включает следующие этапы: 1) об­работка лейкоцитарной массы индукторами интерферона; 2) выделение из обработанных клеток смеси иРНК; 3) получение суммарных комплемен­тарных ДНК с помощью обратной транскриптазы; 4) встраивание кДНК в плазмиду кишечной палочки и ее клонирование; 5) отбор клонов, содержащих гены интерферона; 6) включение в плазмиду сильного промо­тора для успешной транскрипции гена; 7) экспрессия гена интерферона, т.е. синтез соответствующего белка; 8) разрушение прокариотических клеток и очистка интерферона с помощью аффинной хроматографии.

Интерфероны применяются для профи­лактики и лечения ряда вирусных инфекций. Их эффект определяется до­зой препарата, однако высокие дозы интерферона оказывают токсическое действие. Интерфероны широко применяются при гриппе и других острых респираторных заболеваниях. Препарат эффективен на ранних стадиях за­болевания, применяется местно. Интерфероны оказывают терапевтическое действие при гепатите В, герпесе, а также при злокачественных ново­образованиях.

Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувс­твительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединитель­ной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделя­ют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферон вырабатывается лейко­цитами и он получил название лейкоцитар­ного; бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами - клетками соединительной ткани, а гамма-интерферон - иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 меж­дународная единица - ME - это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД 50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании виру­сами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили название интерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интер­ферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размноже­ние) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со спе­циальными рецепторами клеток и оказыва­ет влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона . Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или пос­тупать в организм извне. Поэтому его использу­ют с профилактической целью при многих ви­русных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепати­ты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и забо­леваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффек­тивен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона . Получают интерферон двумя способами: а) путем инфи­цирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конс­труируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом - путем выра­щивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, получен­ный генно-инженерным способом, носит на­звание рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил офици­альное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел ши­рокое применение в медицине как профилак­тическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

Плесневые грибы - продуценты антибиотиков. Особенности строения клетки и цикла развития при ферментации. Антибиотики, образуемые плесневыми грибами.

Биотехнология (Быков 2009) с.28-40.

Пле́сневые грибы́ , или пле́сень - различные грибы (в основном, зиго- и аскомицеты) образующие ветвящиеся мицелии без крупных, легко заметных невооруженным глазом, плодовых тел.

Семейства и виды плесневых грибов

• Penicillium spp.
• Aspergillus
• Moniliaceae
• Dematiaceae
• Fusarium
• Acremonium
• Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae )
• Onychocola canadensis

Распространение в природе

Плесневые грибы распространены повсеместно. В основном, обширные колонии вырастают в тёплых влажных местах, в питательных средах.

Штамм (от нем. Stammen , буквально - происходить) - чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определенном месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят из клональных линий, генетически и морфологически идентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.

Отнесение микроорганизма к определённому виду происходит на основе достаточно широких признаков, таких как тип нуклеиновой кислоты и строение капсида у вирусов; способности расти на определённых углеводородах и тип выделяемых продуктов обмена веществ, а также консервативных последовательностях генома у бактерий. Внутри вида существуют вариации относительно, размера и формы бляшек (негативные «колонии» вируса) или колоний микроорганизма, уровню продукции ферментов, наличию плазмид, вирулентности и т. п.

В мире не существует общепризнанной номенклатуры названия штаммов, и используемые названия достаточно произвольны. Как правило, они состоят из отдельных букв и цифр, которые записываются после видового названия. Например, один из самых известных штаммов кишечной палочки - E. coli K-12.

Плесневые грибы достаточно широко используются человеком.

• Штаммы гриба Aspergillus niger применяются для производства лимонной кислоты из сахаристых веществ
• Штаммы Botrytis cinerea («Благородная гниль») участвует в созревании некоторых вин (херес).
• Другие виды плесеней (т. н. «благородная плесень») используются для выделки специальных сортов сыра (рокфор, камамбер).
• Часто плесень поражает плодовые тела съедобных грибов и делает их непригодными для сбора. Но иногда такие грибы становятся особыми объектами грибной охоты, см. о «грибах-лобстерах» в статье Hypomyces lactifluorum .

Вред от плесневых грибов

Опасность для человека

Микотоксины и антибиотики

Многие плесневые грибы вырабатывают вторичные метаболиты -антибиотики и микотоксины, угнетающе или токсично действующие на другие живые организмы. Наиболее известны следующие вещества

• Микотоксины:
• Афлатоксин
• Антибиотики:
• Пенициллин
• Цефалоспорины
• Циклоспорин

Многие антибиотики вынужденно используются в концентрациях, близких к токсическим. Так, антибиотики гентамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, канамицин и другие могут оказать нефро- и ототоксическое действие.

Патогены

Некоторые плесневые грибы могут вызывать заболевания животных и человека - аспергиллёзы, онихомикозы и другие.

Плесневые грибы и сельское хозяйство

Некоторые плесневые грибы, существенно снижая урожай, могут оказывать неблагоприятное действие на здоровье сельскохозяйственных животных.

Грибы поражают запасы зерна, фураж, солому и сено. Иногда продукты становятся непригодными к использованию из-за токсичности метаболитов гриба.

При сильном развитии плесневых грибов в соломе возможно саморазогревание и даже воспламенение стогов.

Механизмы резистентности

• У микроорганизма может отсутствовать структура на которую действует антибиотик (например бактерии рода микоплазма (лат. Mycoplasma ) нечувствительны к пенициллину, так как не имеют клеточной стенки);
• Микроорганизм непроницаем для антибиотика (большинство грам-отрицательных бактерий невосприимчивы к пенициллину G, поскольку клеточная стенка защищена дополнительной мембраной);
• Микроорганизм в состоянии переводить антибиотик в неактивную форму (многие стафилококки (лат. Staphylococcus ) содержат фермент β-лактамазу, который разрушает β-лактамовое кольцо большинства пенициллинов)
• Вследствие генных мутаций, обмен веществ микроорганизма может быть изменён таким образом, что блокируемые антибиотиком реакции больше не являются критичными для жизнедеятельности организма;
• Микроорганизм в состоянии выкачивать антибиотик из клетки [источник не указан 85 дней ] .

Применение

Антибио́тики (от др.-греч. ἀντί - anti - против, βίος - bios - жизнь) - вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

По ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79)

Антибиотик - вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель.

Антибиотики природного происхождения чаще всего продуцируются актиномицетами, реже - немицелиальными бактериями.

Некоторые антибиотики оказывают сильное подавляющее действие на рост и размножение бактерий и при этом относительно мало повреждают или вовсе не повреждают клетки макроорганизма, и поэтому применяются в качестве лекарственных средств.

Некоторые антибиотики используются в качестве цитостатических (противоопухолевых) препаратов при лечении онкологических заболеваний.

Антибиотики не воздействуют на вирусы, и поэтому бесполезны при лечении заболеваний, вызываемых вирусами (например, грипп, гепатиты А, В, С, ветряная оспа, герпес, краснуха, корь).

Терминология

Полностью синтетические препараты, не имеющие природных аналогов и оказывающие сходное с антибиотиками подавляющее влияние на рост бактерий, традиционно было принято называть не антибиотиками, а антибактериальными химиопрепаратами. В частности, когда из антибактериальных химиопрепаратов известны были только сульфаниламиды, принято было говорить обо всём классе антибактериальных препаратов как об «антибиотиках и сульфаниламидах». Однако в последние десятилетия в связи с изобретением многих весьма сильных антибактериальных химиопрепаратов, в частности фторхинолонов, приближающихся или превышающих по активности «традиционные» антибиотики, понятие «антибиотик» стало размываться и расширяться и теперь часто употребляется не только по отношению к природным и полусинтетическим соединениям, но и к многим сильным антибактериальным химиопрепаратам.

Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов. Экспрессия генов, встроенных в плазмиду.

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций. Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержания гомеостаза, причем, все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.

История изучения цитокинов началась в 40-е годы ХХ века. Именно тогда были описаны первые эффекты кахектина – фактора, присутствовавшего в сыворотке крови и способного вызывать кахексию или снижение веса тела. В дальнейшем данный медиатор удалось выделить и показать его идентичность фактору некроза опухолей (ФНО). За последние два десятилетия клонированы гены большинства цитокинов и получены рекомбинантные аналоги, полностью повторяющие биологические свойства природных молекул. Сейчас известно уже более 200 индивидуальных веществ, относящихся к семейству цитокинов.

К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы; фактор некроза опухолей; интерлейкины со сложившимися исторически порядковыми номерами и некоторые другие эндогенные медиаторы. Интерлейкины, имеющие порядковые номера, начиная с 1, не относятся к одной подгруппе цитокинов, связанных общностью функций. Они в свою очередь могут быть разделены на провоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, отдельные регуляторные цитокины.

Классификация цитокинов может проводиться по их биохимическим и биологическим свойствам, а также по типам рецепторов, посредством которых цитокины осуществляют свои биологические функции. Ниже приведена объединенная структурно-функциональная классификация, где все цитокины разделены на группы, в первую очередь с учетом их биологической активности, а также указанных выше особенностей строения молекул цитокинов и их рецепторов [Симбирцев А.С., 2004].

Классификация цитокинов

1. Интерфероны I типа (ИФН a,b,d,k,w,t, ИЛ-28, ИЛ-29 (ИФН l));

2. Колониестимулирующие факторы, гемопоэтины:

– Фактор стволовых клеток;

– Лиганды gp140 (ИЛ-3, ИЛ-5, ГМ-КСФ);

– Эритропоэтин, тромбопоэтин.

3. Семейство фактора некроза опухолей (ФНО, лимфотоксины α и β);

4. Суперсемейство интерлейкина-1 и фактора роста фибробластов (ФРФ):

– Семейство ФРФ

– Семейство ИЛ-1 (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-33 и др.).

5. Семейство интерлейкина-6 (ИЛ-6, ИЛ-11, ИЛ-31).

6. Семейство интерлейкина-10 (ИЛ-10,19,20,22,24,26)

7. Cемейство интерлейкина-12 (ИЛ-12,23,27)

8. Цитокины Т-хелперных клонов и регулирующие функции лимфоцитов (ИЛ-2, ИЛ-4-5, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-21, ИФНg)

9. Семейство интерлейкина 17 (ИЛ-17A, B, C, D, E, F)

10. Хемокины.

11.Факторы роста:

– Суперсемейство фактора роста нервов, тромбоцитарного ростового фактора и трансформирующих ростовых факторов

– Семейство эпидермального ростового фактора (ЭРФ, ТРФα и др.);

– Семейство инсулиноподобных ростовых факторов (ИРФ-I, ИРФ-II).

Цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции основных функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной регуляцией и связанную в первую очередь с поддержанием иммуного гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют двустороннюю взаимосвязь между факторами неспецифической защиты и специфическим иммунитетом.

В клинической практике существует три основных направления использования цитокинов:

1. цитокиновая терапия для активации защитных реакций организма, иммуномодуляции, либо восполнения недостатка эндогенных цитокинов;

2. антицитокиновая иммуносупрессивная терапия, направленная на блокирование биологического действия цитокинов и их рецепторов;

3. цитокиновая генотерапия в целях усиления противоопухолевого иммунитета или коррекции генетических дефектов в системе цитокинов.

Цитокины используются в клинической практике как для системного, так и для местного применения. Системное введение оправдывает себя в тех случаях, когда нужно обеспечить действие цитокинов в нескольких органах для боле эффективной активации иммунитета либо активировать клетки-мишени, расположенные в разных частях организма. Наибольшее клиническое применении в настоящее время нашли цитокины из группы интерферонов (ИФН), прежде всего альфа-ИФН и бета-ИФН, в меньшей степение гамма-ИФН.

Интерфероны – группа белков с противовирусным действием, вырабатываемая эукариотическими клетками в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов – интерфероногенов (РНК-геномные вирусы, двунитчатые РНК, различные полианионы, бактериальные ЛПС).

ИФН обусловливают разнообразные эффекты, проявляющиеся как на клеточном, так и на системном уровне. Для ИФН характерно наличие трех основных эффектов – неспецифического противовирусного, противоопухолевого и иммуномодулирующего. Интерфероны обладают осуществляют ингибицию репродукции многих вирусов. Противовирусное действие интерферона основывается на подавлении соединения вирусной РНК с рибосомами клетки, что приводит к невозможности осуществления репродукции вируса в клетке.

В 70-х годах все ИФН подразделяли на 2 типа: индуцированные вирусами (лейкоцитарный и фибробластный), которые относили к первому типу и индуцированные мутагенами (иммунный) - ко второму. В настоящее время эта классификация утратила свое значение. В 1980 г. комитетом экспертов Всемирной организации здравоохранения была принята и рекомендована к использованию классификация, согласно которой все ИФН человека подразделяют на 3 класса. Они кодируются различными генами и имеют характерную для каждого класса последовательность аминокислот, из которых построены их молекулы. При наличии рекомбинантных вариантов ИФН их обычно обозначают римскими буквами.

Таблица 11- Классификация интерферонов человека

В настоящее время все полученные знания о ИФН можно обобщить в науку «интерфенология», которая включает теоретические и практические (медицинские и фармацевтические) аспекты этой проблемы. В последнее десятилетие произошло 4 важнейших события в интерфенологии (выделены проф. Ф. И. Ершовым, 1996):

Сформулировано понятие «система интерферона» и выявлены ее прямые и обратные связи с системами иммунитета и нейроэндокринной системой;

Открыта множественность генов ИФН-ct (более 20 в клетках человека);

С помощью современных технологических приемов усовершенствованы существующие и созданы препараты ИФН нового поколения, прошли апробацию оригинальные индукторы ИФН;

Определены показания и противопоказания для клинического использования ИФН и их индукторов при вирусных и невирусных заболеваниях.

В качестве индуктора интерфероногенеза используют вакцинный штамм вируса болезни Ньюкасла или вирус Сендай. Предварительное культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 сут. куриных эмбрионах. Основные технологические операции: овоскопия, отбраковка, инкубирование куриных эмбрионов, введение инфекционной взвеси в аллантоисную полость с последующим инкубированием в течение 48-72 часов и стягиванием инфицированной жидкости у погибших куриных эмбрионов. Вирусосодержащую аллантоисную жидкость центрифугируют

Очень важной операцией, определяющей качество готового препарата, является удаление из лейкоконцентрата примесей эритроцитов (стадия 1). Наиболее полно устраняет присутствие эритроцитов в лейкоконцентрате их избирательный лизис раствором хлористого аммония в физиологической концентрации.

Таблица 12- Технологическая схема биосинтеза ИФН-а

Технологическая стадия	Условия
1. Выделение лейкоцитов	Фракционирование лейкомассы с декстра-
	ном и поливиниловым спиртом с после-
	дующим гемолизом. При этом образуется 3
	слоя. 2 верхних слоя подвергают центрифу-
	гированию и ресуспендированию осадка в
	питательной среде.
2. Прайминг (активирование	Лейкоциты 10-20 млн/мл в среде № 199 с
метаболизма лейкоцитов)-	5% плазмы донорской крови, 3 ед/мл,
2-10 ч, 37,5°С	0,0015 ед/мл инсулина, 200 МЕ/мл нативного
	ИФН
3. Введение вируса индуктора
3.1.Индукция 1 ч, 37,5°С	Вирус болезни Ньюкасла (ВБН), в дозе 5
	РЦЦ 50 на 1 лейкоцит
3.2.Отделение неабсорбиро-	Центрифугирование 600х д - 15 мин.,
вавшегося вируса	сбор осадка индуцированных клеток.
4. Биосинтез 18 ч, 37,5°С	Суспензионная культура Лейкоциты 6 млн/мл в среде № 199 с 5% гаммаглобулиновой плазмой, 5мл натрия сукцината, бикарбонат натрия до рН 7,5, антибиотики. Выход ИФН-а 3-4 ME на 1 тыс. лейкоцитов.
5.Инактивация вируса интерферона	Доведение рН среды до 2,2-2,4 и экспозицией полуфабриката не менее 7 суток.
6. Очистка интерферона	Поэтапно: осветляющая, ультрафильтрация, стерилизующая фильтрация

На этапе культивирования лейкоцитов (стадия 2) лейкоконцентрат ресуспендируют в культуральной жидкости, которая, помимо основных компонентов, содержит некоторые белки сыворотки крови, без которых биосинтез ИФН практически не происходит. Также установлено, что при культивировании лейкоцитов, особенно при большой плотности суспензии (10 7 клеток/мл), в них активируются метаболитические процессы, что сопровождается образованием кислых продуктов. В связи с этим важно в период прайминга и биосинтеза ИФН сохранять рН среды в оптимальных пределах. Для поддержания рН среды на необходимом уровне к среде добавляют различные вещества, обладающие буферной емкостью.

Оптимальные условия при выработке ИФН (стадия 4) создаются при культивировании лейкоцитов при 37-37,5°С. Снижение температуры инкубирования до 35°С и ниже, или, напротив, повышение ее до 38°С и выше приводило значительному ослаблению продукции ИФН.

ИФН-а может продуцироваться как в стационарных условиях культивирования, так и в культурах с постоянным перемешиванием клеток. Считается, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно вырабатывают ИФН-а. Большое значение для выживания клеток в суспензионных культурах имеет форма сосудов, высота слоя жидкости и достаточные количества кислорода в воздушной среде. Оптимальные условия для получения титров ИФН-а создаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Предварительная обработка лейкоцитов малыми дозами ИФН-а приводила к увеличению выхода ИФН в 3-10 раз.

После ресуспендирования лейкоциты индуцируют аллантоисными (без оболочки) вирусами болезни Ньюкасл или Сендай. После инкубации в течение 20 часов при температуре 37,5°С, во время которой преимущественное значение имеет поддержание жизнеспособности культур и высокого метаболизма клетки при постоянстве рН, клетки отделяют низкоскоростным центрифугированием (2 000 об/мин.) в течение 40 минут. Активность интерферона в препаратах, полученных в результате описанной процедуры, составляют 30-200 000 ЕД/мл.

В современной биотехнологии все более широко используются методы генной инженерии. Уже во многих лабораториях мира успешно получают и интегрируют в генетический аппарат культивируемых бактериальных или соматических клеток гены, кодирующие образование ряда биологически активных веществ.

Функциональные гены для биотехнологического производства воссоздают методом обратной транскрипции или синтезируют из отдельных нуклеотидов, выделяя из ДНК соответствующих хромосом.

Опыты по переносу генов ИФН человека в бактериальные клетки были начаты в конце 70-х годов. Почти одновременно в 3 научно-исследовательских группах: в Институте молекулярной биологии I Цюрихского университета под руководством Вейсмана, в отделе биохимии Института по исследованию рака в Токио под руководством Т.Танигучи и в США филиалом фирмы «Genentech» под руководством Дж. Геддела.

Все три группы исследователей использовали для клонирования метод обратной транскрипции мРНК интерферонов. В качестве примера рассмотрим ход экспериментов группы Вейсмана.

Для клонирования гена а-ИФН в качестве исходного материала использовали фракцию 12 S поли (А) мРНК (информационная аденилированная РНК), полученную из клеток лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай. На базе информационной РНК получена комплементарная ей ДНК, состоящая из 2 цепей. Полученная двухспиральная ДНК была расщеплена с помощью рестриктаз путем образования липкого конца олиго-dG. Аналогичная операция была проведена с плазмидой с образованием липкого олиго-dС-конца. С помощью лигаз осуществлено встраивание комплементарного ДНК, содержащей информацию о структуре а-ИФН в плазму pBR322.

Эта плазмида несет в своем составе гены, определяющие устойчивость к двум антибиотикам: тетрациклину и ампицилину. Вставка ДНК интерферона инактивирует ген, ответственный за устойчивость к ампицилину, поэтому первичный отбор клеток, получивших гибридные плазмиды, шел по устойчивости к тетрациклину.

Для отбора нужных клонов использовали следующий метод: смесь нескольких плазмид из разных клонов, одна из которых может содержать ДНК интерферона, денатурируют и связывают с твердой подложкой. С этой ДНК гибридизируют образцы РНК, полученные из продуцирующих ИФН клеток человека, фильтры промывают, элюируют РНК в денатурирующих условиях и элюат инъекцируют в овоциты африканской зеленой лягушки для выявления мРНК интерферона. Среди гибридизирующихся клонов выбран один, названный Hif-2h, имеющий вставку соответствующую размеру полного гена a- ИФН.

Клетки кишечной палочки, содержащие гибридные плазмиды, несущие такую вставку способны синтезировать полипептид с биологической активностью интерферона.

Работы по клонированию генов интерферона были повторены и развиты как названными выше авторами, так и другими группами исследователей во многих странах. В СССР первое успешное клонирование гена лейкоцитарного интерферона описано в 1982г. акад. Овчинниковым, фибробластного в 1983 г. -Ю.И. Козловым, иммунного - в 1985 г. Е.Д. Свердловым.

В настоящее время экспрессия генов ИФН произведена не только в клетки кишечной палочки, но и в клетки других грамотрицательных бактерий (Pseudomonas) - лежит в основе промышленного производства ИФН в России. В настоящее время считается, что наиболее эффективно использование для этих целей дрожжей.

Дрожжи рода Saccharomyces не патогенны для человека, имеют многовековой опыт их использования. Дрожжи не подвержены лизису, автолизу, легко сепарируются, используют дешевые субстраты. Биомасса дрожжей не содержит токсичных и пирогенных факторов, как клетки грамотрицательных бактерий.

Весьма важным обстоятельством является также сходство секреторных механизмов дрожжей и высших эукариот, это позволяет предположить, что клонированные гены преинтерферонов смогут давать зрелый ИФН в результате правильного процессинга.

Отработана технология массового культивирования клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН. Так, для отечественного препарата реаферона она включает:

· культивирование бактериального штамма-продуцента реаферона в ферментерах объемом 100 л с выходом 5-7x103 ME из 1 л культуральной жидкости,

· разрушение биомассы методом, позволяющим увеличить процесс с 60-70 %-ным выходом целевого продукта,

· предварительную очистку реаферона на ионнообменнике; окончательную очистку препарата проводят на иммуносорбенте с моноклональными антителами к лейкоцитарному ИФН-а типа 5АС.

Основным продуцентом рекомбинантного ИФН являются бактериальные штаммы, в цитоплазме, которых синтезируется ИФН и составляет лишь доли процента от общей массы бактериальных белков. После накопления в специальных ферментерах достаточно высокой концентрации клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В качестве основных методов лизиса используют: осмотический шок, замораживание-оттаивание, гомогенизирование, обработку детергентами. Затем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифугирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бактериальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к ИФН.

Моноклональные антитела к ИФН «пришивают» к гранулам носителя и помещают в хроматографическую колонку. Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный ИФН. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экстракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят через колонку и удаляются промывным раствором. Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабокислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается. ИФН переходит с поверхности частиц сефарозы в буферный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержащего загрязняющих белков.

Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь), а также с распросранением вирусных заболеваний, передающихся через кровь (ВИЧ, гепатит С). В связи с чем, несмотря на наличие некоторых преимуществ препаратов природных ИФН, в клинике используются практически только рекомбинантные препараты.

Семейство ИФН-а содержит около 20 подтипов, поэтому природные препараты - Человеческий лейкоцитарный интерферон, Эгиферон, Вэлферон многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство из подтипов. Природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напротив, при введении инъекционным путем могут вызвать образование нейтрализующих или связывающих антител.

Наиболее часто используются постые (непегилированные) и пегилированные альфа- и бета-ИФН. Например рекомбинантные ИФН-a2а (Реаферон, Роферон, Пегасис), рекомбинантные ИФН-a2b (Интрон А, Реальдирон, Пег-Интрон), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре lis-his, arg-his, arg-arg, соответственно, которые мало влияют на активность, но существенны с точки зрения сенсибилизации. Так препараты ИФН-a2а, не являющиеся характерными для человеческой популяции, имеют большой риск вызвать сенсибилизацию и образование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапевтический потенциал.

Иммунный интерферон (гамма-ИФН) может рассматриваться в качестве компонента лекарственных средств, предназначенных для лечения вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний. За рубежом создан ряд препаратов на его основе: Иммунерон (США), Иммуномакс (Япония), Имукин (Германия). В России разработана эффективная схема получения высокоочищенного Дельтаферона, основанная на двух последовательных хроматографиях на одном сорбенте, но при разных значениях рН. Данная схема позволяет получать рекомбинантный Дельтаферон в препаративных количествах с допустимым содержанием высокополимерных примесей. Изменения в белковой молекуле (укорочение молекулы на 10 аминокислот и 3 аминокислотные замены) привели к 20-кратной потере антивирусной активности по сравнению с полноразмерным ИФН-γ, но не сказались на его иммуномодулирующих свойствах. В результате данной модификации у дельтаферона появилась устойчивость к протеолитическим ферментам. Разработаны экспериментальные лекарственные формы дельтаферона, которые позволяют сохранять белок в нативном состоянии без потери специфической активности. ЛФ дельтаферона обладают присущими исходному гамма-интерферону иммуномодулирующими свойствами.

С фармакологической точки зрения препараты ИФН должны рассматриваться, прежде всего, как иммуномодуляторы, оказывающие воздействие на функциональную активность эффекторных клеток иммунной системы и прежде всего Т-лимфоцитов и моноцитов (макрофагов). Под действием ИФН повышается эффективность иммунного распознавания антигена и усиливаются фагоцитарная и цитолитическая функции, направленные на элиминацию возбудителя или антигенно-измененных клеток. Интерферон циркулирует в организме около 2-х недель, что следует учитывать при применении его как профилактического средства.

Многолетний опыт показал, что при интраназальном введении ИФН обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении различных вирусов гриппа и парагриппа. Защитное действие наиболее выражено при ежедневном применении препарата с помощью ингаляторов или распылителей. Многократные интраназальные инсталляции или ингаляционное введение раствора препарата через нос и рот в форме аэрозоля в течение первых двух дней болезни приводило к более быстрому снижению явлений интоксикации и лихорадочной реакции. Быстрее уменьшались и выраженность воспалительных явлений в верхних дыхательных путях. Исследования последних лет показали, что ИФН подавляет размножение опухолевых клеток, что делает его эффективным при лечении опухолевых заболеваний. Противоопухолевое действие ИФН можно объяснить стимуляцией естественных защитных механизмов организма, в частности на лимфоциты, которые убивают раковые клетки или образуют антитела.

К настоящему времени определен круг заболеваний, при которых эффективно использование ИФН. Из вирусных инфекций - это ОРВИ, грипп, энцефалиты, вирусные гепатиты, герпетические поражения глаз (конъюнктивиты, кератоконъюктивиты), слизистых оболочек и глаз. По мнению клиницистов при герпетических поражениях кожи и слизистых оболочек следует отдавать предпочтение местному применению препарата. ИФН нашел применение при пересадках органов как средство, предупреждающее вторичные вирусные инфекции. Краткий анализ позволяет заключить, что ИФН способен положительно влиять на развитие самых различных заболеваний вирусной этиологии. Его эффективность наиболее выражена при острых инфекциях, на ранних сроках заболевания. При клиническом использовании следует отдавать предпочтение местному введению, обеспечивающему минимальный расход препарата. Кроме того, местное применение позволяет избежать отрицательных явлений, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИФН.

Каждая лекарственная форма имеет свою область применения, обусловленную ее иммунобиологическими и фармакологическими свойствами. Это положение формулируется следующим образом:

Препараты ИФН не должны вызывать явлений сенсибилизации при длительном многократном применении прерывистыми курсами. Биосинтез ИФН для приготовления различных лекарственных форм может проводиться по единой технологической схеме, но способы очистки ИФН и ее критерии должны отвечать задачам терапии. В инъекционных лекарственных формах примеси, антигенные для человека, должны отсутствовать. Их уровень в препаратах для местного пользования должен быть ниже порога сенсибилизации.

Теоретически в природных препаратах ИФН-a могут присутствовать 3 основные группы антигенов:

· антигены вируса-индуктора и куриной аллантоисной жидкости;

· эритроцитарные антигены, определяющие группу крови и резус-принадлежность;

· лейкоцитарные антигены HLA.

Биотехнология получения ИФН должна включать операции, ограничивающие возможность проникновения этих антигенов в лекарственные формы. Технологически наиболее трудной задачей является удаление анитигенов I группы, так как на стадии индукции их вводят в суспензию в большом количестве.

Препараты природного ИФН-a в зависимости от методов очистки можно разделить на две группы - нативные и концентрированные. Препараты нативного типа по белковому составу практически не отличается от исходных полуфабрикатов, характеризуются невысокой удельной активностью - до 1-104 ME на 1 мг белка, но сохраняют все цитокины, продуцированные в процессе интерфероногенеза, в их естественном соотношении. Поэтому они обладают высоким потенциалом иммунобиологического действия.

Биотехнология получения концентрированных препаратов включает химическую очистку, что приводит к снижению потенциала иммунобиологического действия из-за утраты цитокинов. Однако эти препараты представляют также ценность для практического здравоохранения. Например, высококонцентрированный человеческий лейкоцитарный ИФН – ЧЛИ для инъекций –пока незаменим в ситуациях, когда необходимо ввести высокие разовые дозы (лимфобластный лейкоз в стадии обострения), а также при лечении вирусных и онкологических поражений, локализованных за гематоэнцефалическим барьером. К препаратам концентрированного типа относится и интерлок, который успешно применяют для местного лечения вирусных поражений глаз.

Третью группу составляют рекомбинантные ИФН, представленные реафероном и реальдоном. При многих формах патологии препараты для местного применения (интраназальные капли, мазь, ректальные суппозитории, глазные пленки и др.) более эффективны, чем инъекционные. Например, при активном хроническом ВГВ использование ректальных суппозиториев, содержащих всего 100 000 ME ИФН-а, дает такие же результаты, как и внутримышечное введение высококонцентрированного препарата в дозе 3 ME. Расход препарата и стоимость лечения при применении ректальных суппозиториев снижается в десятки раз.

Современные рекомбинантные препараты ИФН:

Реаферон (человеческий рекомбинантный ИФН-а2) производство НПО «Вектор» г. Новосибирск.

· получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonas sporogenosa, содержащего в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИФН-а2 человека.

· предназначен для внутримышечного, субконъюнктиванного и местного применения.

Выпускается в виде лиофилизированного порошка в ампулах.

Интрон А (человеческий рекомбинантный ИФН-a2b) фирмы Schering Plough -США.

Препарат получен по рекомбинантной ДНК-технологии с использованием бактериальных E.coli, содержащих встроенный генно-инженерным путем ген, кодирующий этот человеческий белок.

Спецификация активности 2*108 МЕ/мг белка.

Введение больших доз белка сопровождается повышением температуры, появлением головной боли, расстройством желудочно-кишечного тракта (тошнота, иногда обострение гепатита), возникают нарушения в работе сердечно-сосудистой системы.

На основании изучения онтогенеза системы ИФН разработан новый отечественный препарат виферон-суппозитории, включающие в себя рекомби-нантный ИФН-а, и препараты антиоксидантного действия. Виферон положительно зарекомендовал себя при лечении вирусных и бактериальных заболеваний у новорожденных детей: внутриутробный герпес, хламидиоз, ОРВИ, кандидоз

Пегилированные интерфероны

Противовирусная терапия - одна из основных областей перспективного использования пегилированных препаратов пептидной структуры. Ярким примером использования концепции пегилирования биотехнологических препаратов является создание пегилированных интерферонов (пег-ИФН). К клинической практике, в настоящее время, применяются пегилированные аналоги альфа-интерферона - ПЭГ-интерферона-альфа 2b (Пегинтрон; Shering Plough) и ПЭГ-интерферона-альфа 2а (Пегасис; Hoffmann La Roche).

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий :

Ген интерферона должен содержать три участка расщепления рестриктазой Sau 3A1, из которых один находится рядом с сигнальной частью.

Неполное расщепление гена этим ферментом позволяет выделить фрагмент гена, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый интерферон.

Триплет ATG, кодирующий цистеин, отщепляется ферментом вместе с сигнальной частью.

Для восстановления полинуклеотидной последовательности полного гена химически был синтезирован фрагмент ДНК, содержащий этот триплет, а также примыкающий к нему триплет ATG-точка инициации синтеза белка.

Этот фрагмент присоединили к изолированной части зрелого гена, в результате был восстановлен полный ген зрелого интерферона.

Реконструированный ген ввели в плазмиду таким образом, что с ним оказался рядом участок ДНК-промотор, обеспечивающий начало синтеза мРНК.

Экстракты из E. Coli, содержащие такую плазмиду, обладали противовирусной активностью.

Синтезированный генно-инженерным способом интерферон был выделен, очищен, и его физико-химические свойства оказались близкими свойствам интерферона, полученного из крови доноров. Удалось получить бактерии , способные синтезировать до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, содержащей примерно 10 11 бактериальных клеток, что в 5000 раз превосходит то количество интерферона, которое можно извлечь из 1 литра крови доноров.

В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликолизирование.

В 1991 году в США впервые для синтеза лейкоцитарного интерферона человека были употреблены генетически сконструированные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученнаяэффективная экспрессия гена LeIF и замена бактерий клетками дрожжей позволили увеличить производство интерферона в 10 раз.

В России в 1994 году был осуществлён полный синтез гена α- И размером примерно 600 н. п. (нуклеотидных пунктов) в Институте биоорганической химии под руководством Н. М. Колосова.

Несмотря на успехи, достигнутые в области получения интерферонов с помощью генно-инженерных технологий и их применения для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе онкологических, предстоит решить ещё многие вопросы, касающиеся расшифровки механизмов их биосинтеза и взаимодействия с другими веществами.

Схема биологического действия интерферона представлена на рисунке 8.34.

Рис. 8.34. Механизм действия интерферона

Механизм действия интерферона можно свести к следующим основным этапам:

1. Связываясь с клеточными рецепторами, интерфероны инициируют синтез ферментов 5"-олигоаденилансинтетазы и протеинкиназы за счёт инициации транскрипции соответствующих генов;

2. Оба фермента проявляют свою активность в присутствии двухцепочных ДНК, являющихся продуктами репликации многих вирусов;

3. Фермент 5"-олигоаденилансинтетаза катализирует синтез 2" 5"-олигоаденилатов (из АТР), которые активируют клеточную рибонуклеазу;

4. Протеинкиназа фосфорилирует и тем самым активирует фактор инициации трансляции IF 2. В результате этих событий ингибируется биосинтез белка и размножение вируса (деградация иРНК и рРНК) в инфицированной клетке, что вызывает её лизис.

10267 0

Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в головном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был выделен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке соматотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек.

Гормон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной карликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Исследования показали, что при внутримышечном введении соматотропина в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8-18 см в год.

Больные дети четырех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверстников к половой зрелости (14-16 лет). Если учесть тот факт, что из одного трупа можно получить 4-6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином - дело совершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и другие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала.

Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе кишечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образованием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 этапе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и тесты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадеживающими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

Еще один гормон, в-эндорфин - опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, - был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую в-эндорфин, в клетках E. ooli и получили этот полипептид в виде слитного белка с ферментом в-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обратной транскрипции и-РНК, кодирующей в-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E .coli за геном в-галактозидазы, при этом получили гибридный белок, состоящий из в-галактозидазы и в-эндорфина; далее ферментативно отщепляли в-галактозидазу, получая биологически активный в-эндорфин.

Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии является синтез интерферона.

Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, который выделяется в очень низких количествах клетками животных и человека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ними. Первые же исследования выявили высокую биологическую активность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых заболеваний (подавляет размножение аномальных клеток).

Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны животных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

В организме человека вырабатывается несколько видов интерферонов: лейкоцитарный (а), фибробластный (Р) и иммунный (у) (Т-лимфоцитарный).

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1 г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одинаков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч фильтровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографической очистке.

Стоимость препарата была очень велика - 400 г интерферона стоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологического его использования (в том числе против четырех видов рака) заставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помощью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало даже в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1-2 молекул интерферона на одну бактериальную клетку.

В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую у-интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки млекопитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом - 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1 млн единиц интерферона (единица интерферона соответствует такому его количеству, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения вирусом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили молекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

Получение иммуногенных препаратов и вакцин

Другая область применения генной инженерии связана с получением новых эффективных, безопасных и дешевых вакцин.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний.

Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10-15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство принципиально новых вакцин.

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:
- живые аттенуированные вакцины;
- инактивированые вакцины;
- вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);
- рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии

Технологию рекомбинантных ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленной мутации генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуно-генные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют иначе генными или генетическими.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий.

Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами:
- способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных протеинов;
- способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов;
- могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов;
- способствуют формированию длительного иммунитета;
- устраняют риск инфицирования.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик