Диагностика протозойных инфекций. Гельминтологические методы исследования

Прямые методы: выявление самих гельминтов, их фрагментов, яиц, личинок в фекалиях, моче, дуоденальном секрете, мокроте, носовой и влагалищной слизи, содержимом подногтевых пространств, биопсированных кусочках ткани.

При диагностике нельзя каким-либо одним методом выявить яйца или личинки всех видов гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека. Так, при использовании метода флотации в поверхностную пленку не всплывают (из-за высокого удельного веса) яйца трематод, в некоторых случаях неоплодотворенные яйца аскарид. В кале очень редко можно обнаружить яйца остриц, онкосферы тениид, которые выявляются специальными методами исследований: соскоб с перианальных складок для остриц и тениид, методы осаждения для трематод (яйца описторха и др.). Поэтому для целенаправленного обследования больного на гельминтозы врач в направлении должен указать, на какие гельминты следует обратить основное внимание (диагноз), что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления данного вида гельминта. Фекалии, взятые из разных мест испражнений в количестве не менее 50 граммов (чайная ложка) в чистую стеклянную посуду, должны быть отправлены в лабораторию не позднее чем через сутки после дефекации и исследованы в день поступления.

В случае необходимости сохранения кала до следующего дня его помещают в холодное место (0-4°С) или заливают одним из консервантов.

Перед исследованием кал перемешивают палочкой, чтобы яйца гельминтов оказались равномерно распределенными в общей массе.

При обнаружении в препарате яиц какого-либо гельминта просмотр не прекращают, т.к. может быть двойная или тройная инвазия.

Контроль за эффективностью лечения гельминтозов осуществляется путем исследования фекалий на яйца гельминтов через 2-3 недели или через 2-3 месяца после лечения в зависимости от обнаруженного гельминта.

Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы.

Часто на поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; выделяются с калом аскариды; иногда люди сами замечают отхождение гельминтов. У больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде "белых обсечек") или они активно выползают из анального отверстия.

Макроскопический метод является основным для дифференциальной диагностики тениидоза и тениаринхоза (в сочетании с опросом).

Из специальных макроскопических методов применяется метод последовательного промывания фекалий.

Фекалии размешиваются в воде для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении их тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы, крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, и рассматривают их под лупой между двумя предметными стеклами. Мелких гельминтов или головки цестод рассматривают под лупой в капле глицерина или под микроскопом.

При использовании этого метода для диагностики члеников свиного, бычьего цепней, широкого лентеца отмытые членики помещают между двумя стеклами и, просматривая на свет под лупой или малым увеличением микроскопа, определяют видовую принадлежность по строению матки (у зрелого членика свиного цепня от центрального ствола отходят 8-12 боковых ответвлений, а у бычьего цепня 18-32, чаще 28-32, у широкого лентеца членики больше в ширину и матка в центре в виде "розетки"). Если матку плохо видно, то ее предварительно можно подержать некоторое время в 50% растворе глицерина, после чего даже запустевшие стволы матки просматриваются хорошо.

При определении этих цестод по строению отошедших головок их с шейкой осторожно кладут в каплю глицерина между предметными стеклами (или покрывают покровным стеклом) и, не передавливая, рассматривают под микроскопом при малом увеличении.

Микроскопические методы подразделяются на простые, сложные и специальные.

К простым относятся методы нативного мазка, нативный мазок раствором Люголя, методы толстого мазка под целлофаном по Като, закручивания (по Шульману) и перианального соскоба.

Сложные методы являются более эффективными и основаны на концентрации яиц в препаратах. Они включают в себя предварительную обработку фекалий жидкими реактивами, в результате чего яйца гельминтов или выпадают в осадок, или всплывают на поверхность жидкости.

К сложным методам относятся методы обогащения:

а) флотационные (когда удельный вес яиц меньше удельного веса солевого раствора и яйца всплывают в поверхностную пленку);

б) седиментационные (когда удльный вес яиц больше удельного веса солевых растворов и яйца оседают в осадок).

Специальными методами обнаружения яиц и личинок гельминтов, цист и вегетативных форм простейших являются методы соскоба, флотации, седиментации, ларвоскопии, протозооскопии, исследование желчи и методы окраски мазков кала, мокроты и др.

Простые методы исследования фекалий

Нативный мазок . Небольшую частицу испражнений берут деревянной палочкой из различных участков доставленной порции, хорошо растирают на предметном стекле в капле 50%-ного раствора глицерина и делают на 2-3 предметных стеклах тонкий мазок. Просматривают под микроскопом не менее 3 препаратов. Недостаток метода: просматривается малое количество материала, поэтому как самостоятельный метод не применяется.

Метод закручивания (Шульмана). 2,0-3,0 г испражнений кладут в стаканчик, тщательно размешивают стеклянной палочкой с 5-кратным объемом физиологического раствора или дистиллированной воды, производя быстрые движения в течение 2-3 мин, и быстро вынимают палочку из смеси. Каплю смеси на конце палочки переносят на предметное стекло и микроскопируют. Принцип центробежной силы вызывает скопление яиц и личинок на палочке.

Метод толстого мазка по Като с целлофаном . Химические реактивы:100%-ный глицерин, 6%-ный раствор фенола (100 мл воды + 6 г фенола), 3%-ный раствор малахитовой зелени (2,5 мл дистиллированной воды + 75 мл малахитовой зелени).

Приготовление рабочего раствора: 100 мл 6%-ного раствора фенола + 100 мл чистого глицерина + 1,2 мл 3%-ного раствора малахитовой зелени.

Приготовление целлофановых полосок: нарезаются полоски из целлофана, размер которых соответствует предметному стеклу. Целлофан должен быть гидрофильный (пригоден целлофан, который горит; если плавится, то непригоден). В рабочем растворе можно обработать до 5 тыс. полосок. Срок экспозиции целлофановых полосок до готовности к употреблению в рабочем растворе не менее 24 час.

Ход исследования. На предметное стекло наносят 50 мг фекалий (с крупную горошину), растирают индивидуальной палочкой (стеклянной, деревянной), накрывают целлофановой полоской и сверху притирают резиновой пробкой до получения равномерного толстого мазка. Препарат высушивают при комнатной температуре в течение часа или в термостате при 40°С в течение 20-30 мин и микроскопируют (время выдержки можно увеличить при комнатной температуре до 5-6 час и более).

По эффективности данный метод приближается к методу флотации, но выявляет инвазию интенсивную и средней интенсивности.

Применяется как самостоятельный метод диагностики и рекомендуется для массового обследования населения.

В клинико-диагностических лабораториях применяется как унифицированный метод диагностики гельминтов при отсутствии в направлениях врачей конкретных диагнозов.

Методы перианального соскоба и нативного мазка с раствором Люголя описаны в разделе специальных методов.

Сложные методы обогащения фекалий

В основу методов обогащения положена разность удельного веса яиц гельминтов и применяемого солевого раствора.

При применении метода флотации могут быть использованы следующие солевые растворы:

1. Раствор нитрата свинца PbNO3 (азотнокислого свинца) с плотностью 1,5. Готовится из расчета 650 г вещества на 1 л воды. Соль растворяют порциями в горячей воде в эмалированной посуде, подогревая на плите и постоянно помешивая до полного растворения. Фильтровать раствор не обязательно. Раствор готовят в день исследования, так как со временем он дает осадок, и плотность его начинает падать уже через 24 ч. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают, размешивая осадок. Приготовление раствора производится в вытяжном шкафу, так как нитрат свинца – соль тяжелого металла.

2. Раствор нитрата аммония NH4NO3 (гранулированной или обычной аммиачной селитры) с плотностью 1,3 готовят так же, как и предыдущий, но из расчета 1500 г вещества на 1 л горячей воды.

3.Раствор нитрата натрия NaNO3 или азотнокислого натрия с плотностью 1,38-1,4 готовят из расчета 1000 г вещества на 1 литр горячей воды.

4. Раствор тиосульфата натрия Na2S2O3×5H2O (гипосульфита натрия) с плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества на 1 л горячей воды.

5. Раствор сульфата натрия Na2SO4 (английской соли) с плотностью 1,26-1,28 готовят из расчета 920 г вещества на 1 л горячей воды.

6. Раствор хлорида цинка ZnCl2 (хлористого цинка) с плотностью 1,82 готовят из расчета 2000 г вещества на 1 л горячей воды. Остывший раствор не кристаллизуется.

7. Насыщенный раствор хлорида натрия NaCl (поваренная соль) с плотностью 1,18-1,2. На! л воды добавляют 400-420 г соли порциями в эмалированное ведро с кипящей водой, постоянно размешивая до полного растворения. При остывании раствора выпадают кристаллы хлорида натрия.

Удельный вес флотационных растворов измеряется аэрометром только после полного остывания раствора при комнатной температуре.

Методы флотации наиболее эффективны для обнаружения яиц карликового цепня, власоглава, анкилостомид, аскарид, широкого лентеца.

Поверхностную пленку можно снимать с помощью проволочной петли или предметного стекла.

В насыщенном растворе поваренной соли пленку можно исследовать через 30-40 мин, в растворе аммиачной селитры – через 10-20-30 мин после отстаивания.

При снятии пленки проволочной петлей исследуют не менее 8 капель.

Предметные стекла снимают с пленки больше яиц, чем проволочные петли. Стекло должно соприкасаться с жидкостью флотационного раствора, которую добавляют в стаканчик пипеткой. После отстаивания стекло снимают, кладут смоченной поверхностью вверх на стекло большего размера и исследуют под микроскопом. Предметные стекла перед использованием обязательно обезжиривают.

Для проведения исследований необходимо иметь: предметные стекла, химические стаканчики, проволочные петли, кюветы, чашки Петри, пипетки, груши, стеклянные или деревянные палочки.

Ход исследования. 5 г фекалий заливают 10-кратным количеством флотационного раствора (лучше удельным весом 1,38-1,40), тщательно размешивают, снимают сверху не растворяющиеся крупные частицы и оставляют взвесь на 10-15 мин. Затем пленку снимают либо петлей на предметное стекло, либо предметным стеклом. Для разведения испражнений лучше взять стаканчики емкостью 30-50 мл, налить раствор вровень с краями (или недоливать 2-3 мм) и смесь покрыть предметным стеклом, а затем пипеткой добавить флотационный раствор до его соприкосновения с предметным стеклом. Через 10-20 мин стекло быстро снять и оставшуюся на нем пленку микроскопировать без покровного стекла.

Методы осаждения-седиментации

Методы седиментации применяются для выявления в кале яиц геогельминтов, биогельминтов и как специальные методы исследования на описторхоз.

Метод Горячева-Золотухина (упрощенный метод Горячева). Около 1,5 г кала размешивают в химическом стаканчике в 3-4 мл воды. Полученную взвесь фильтруют через два слоя марли в центрифужную пробирку, наслаивая осторожно сверху на имеющиеся в ней 4-5 мл насыщенного раствора поваренной соли. Пробирки ставят в штатив на 15-20 ч. За это время тяжелые яйца трематод оседают. Получают два четко разграниченных слоя. Осадок микроскопируют.

Эфир-формалиновый метод. Применяется для диагностики всех кишечных инвазий и как специальный метод на простейшие и яйца описторхов.

Оборудование: центрифуга на 3000 об/мин; центрифужные градуированные пробирки, воронки; металлическое ситечко (чайное) или двухслойный бинт; предметные и покровные стекла; деревянные (или стеклянные) палочки; вата, бинт.

Химреактивы: 10%-ный раствор формалина (1 часть раствора формалина аптечного и 4 части дистиллированной воды); этиловый эфир (медицинский).

В центрифужные пробирки наливают 7 мл 10%-ного раствора формалина и помещают 1 г фекалий (такое количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 8 мл). Фекалии смешивают с формалином до образования однородной смеси, а затем через металлическое ситечко (или двухслойную марлю, бинт) переливают в другую центрифужную пробирку (если на ситечке остались фекалии, то ситечко надо ополоснуть формалином). Добавить 2 мл эфира в эту центрифужную пробирку, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 сек.

Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение одной минуты (можно в течение двух минут при 1500 об/мин). За счет реакции эфир-формалина происходит коагуляция белков в виде пробки вверху пробирки, а в осадок выпадают яйца гельминтов. Слой коагулянта убирают, сливается надосадочная жидкость, осадок наносится на предметное стекло прямо из пробирки или пастеровской пипеткой, накрывается покровным стеклом и просматривается под микроскопом.

Метод эфир-уксусного осаждения . Принцип эфир-уксусного осаждения яиц гельминтов заключается в последовательной обработке проб фекалий 10%-ным водным раствором уксусной кислоты и эфиром. Уксусная кислота лучше других химических соединений эмульгирует пробу фекалий. Она проникает в непереваренные частицы, состоящие преимущественно из клетчатки, которые при большом содержании мешают исследованиям, выпадая в осадок после центрифугирования. Последующее добавление в пробирку эфира и перемешивание приводит к извлечению из содержимого пробирки уксусной кислоты вместе с пропитанными ею каловыми частицами. Так как удельный вес смеси эфира с уксусной кислотой меньше удельного веса воды, пробы кала, обработанные этими веществами, всплывают, а яйца гельминтов, обладающие большим удельным весом, оседают.

Количество осадка, полученного после эфир-уксусного осаждения, в 3-4 раза меньше, чем после эфир-формалинового. Это значительно облегчает обнаружение в нем яиц гельминтов и позволяет исследовать осадок целиком при навеске в 0,5-1 г. Токсичность эфир-уксусного метода в 5 раз ниже.

Ход исследования. В градуированную центрифужную пробирку наливают 7 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и вносят навеску кала 1 г (т.е. такое количество кала, при котором раствор уксусной кислоты поднимается до 8 мл). Тщательно размешивают стеклянной или деревянной палочкой. Процеживают через воронку с двумя слоями марли в другую центрифужную пробирку. К эмульгату добавляют 2 мл этилового эфира (т.е. до 10 мл). Пробирки закрывают резиновой пробкой (можно от пенициллинового флакона) и встряхивают 15 сек. Убрав пробку, пробирки центрифугируют в течение одной минуты при 3000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость из пробирки сливают. В некоторых случаях образовавшаяся каловая пробка мешает сливу надосадочной жидкости. В этом случае стеклянной или деревянной палочкой отделяют пробку от стенок пробирки. Осадок пипеткой целиком переносят на предметное стекло и микроскопируют под покровным стеклом при малом увеличении. Осадок, как правило, небольшой, бесцветный. Яйца гельминтов, особенно мелкие яйца трематод, хорошо обнаруживаются.

Химико-седиментационный метод . Принцип исследования основывается на осаждении яиц из пробы фекалий в солевом растворе с удельным весом 1,15. Сущность метода заключается в непосредственном центрифугировании пробирки, в которой на раствор азотнокислого натрия (уд. вес 1,16) наслоена пробка кала, эмульгированная в 1%-ном растворе уксусной кислоты. Высокий удельный вес солевого раствора и выделяемые за счет химической реакции пузырьки, пронизывающие слой гомогенизированного кала, препятствуют его осаждению. Яйца гельминтов выпадают в осадок с небольшим количеством клетчатки. Осадок можно очистить от оставшегося детрита, обработав его 10%-ным раствором уксусной кислоты и эфиром. В этом случае остаются только одни яйца гельминтов, что значительно облегчает их выявление.

Ход исследования. В градуированную центрифужную пробирку наливают 6 мл раствора азотнокислого натрия с удельным весом 1,15. В другую пробирку наливают 7 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты. Вносят пробу фекалий (до метки 7,5 мл при пробе 0,5 г и до 8 мл при пробе в 1,0 г). Тщательно перемешивают пробу стеклянной палочкой. Процеживают через воронку с одним слоем марли, наслаивая на раствор азотнокислого натрия. Пробирку с наслоенным фильтратом центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 5 мин. Быстрым переворачиванием пробирки сливают надосадочную жидкость. В пробирку с осадком добавляют 3-4 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и 0,5 мл эфира, закрывают резиновой пробкой и встряхивают. Проводят повторное центрифугирование в течение 1 мин. Сливают надосадочную жидкость. Осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

ГЕЛЬМИНТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖЕЛЧИ, ДУОДЕНАЛЬНОГО СОДЕРЖИМОГО, МОКРОТЫ, КРОВИ, МОЧИ И МЫШЦ

Обнаружение яиц и личинок гельминтов в дуоденальном содержимом и желчи. Исследование желчи и дуоденального содержимого производится при подозрении на гельминтозы печени и желчного пузыря (описторхоз, клонорхоз, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишки (стронгилоидоз).

Ход исследования. Дуоденальное содержимое и желчь (порции А, В, С) получают обычным путем при помощи зондирования. Для порции В рекомендуется обязательно получать рефлекс желчного пузыря введением через зонд 33% раствора сернокислой магнезии. Из исследуемой жидкости выбирают и просматривают под микроскопом плавающие в ней хлопья, а затем смешивают ее с равным количеством серного эфира. Смесь тщательно взбалтывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а весь осадок исследуют под микроскопом.

При отсутствии гноя и слизи желчь и дуоденальное содержимое центрифугируют, не смешивая с эфиром.

Исследование мокроты. В гельминтологической практике исследование мокроты проводится с целью лабораторной диагностики парагонимоза. Иногда при этом выявляются яйца шистосом, личинки аскариды, элементы эхинококкового пузыря.

Из мокроты готовят нативный мазок на предметном стекле, который исследуют под микроскопом.

При обильном содержании в мокроте гноя ее смешивают с 0,5% раствором едкого натра или едкого калия, встряхивают в течение 5 минут и центрифугируют. Осадок микроскопируют.

Исследование крови. Кровь исследуют при подозрении на наличие у больного филяриозов.

В связи с тем, что при некоторых видах филяриозов (лоаоз, вухерериоз, вызванный субпериодическим штаммом) личинки (микрофилярии) бывают в периферической крови только днем, а при некоторых (бругиоз, вухерериоз, вызванный периодическим штаммом) – только ночью, соответственно в это время берут кровь для анализа.

Техника забора крови, приготовления препаратов (тонкий мазок и толстая капля), их окрашивания (по Романовскому) и исследование аналогичны таковым при лабораторной диагностике малярии.

Микрофилярии разных видов отличают по длине, ширине, изгибу тела, наличию или отсутствию чехлика, форме хвостового конца, расположению ядерной субстанции в теле и хвостовом отделе личинок.

Ход исследования. Мочу отстаивают не менее 30 мин, затем верхний слой сливают, оставляя 10-15 мл осадка, которые разливают в центрифужные пробирки, и центрифугируют в течение 1-2 мин. Слив надосадочную жидкость, осадок переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОПТАТОВ МЫШЦ

Метод трихинеллоскопии . Необходимость в исследовании биоптатов мышц больного возникает при подозрении на трихинеллез.

Биопсия проводится по общим правилам. Обычно делают биопсию дельтовидной мышцы. При паталогоанатомическом исследовании можно делать биопсию мышц диафрагмы, пищевода, языка, жевательных и межреберных мышц, сгибателей конечностей, мышц глазного яблока, так как они наиболее интенсивно поражаются личинками трихинелл.

В лаборатории биопсированный кусочек мышц разрезают на очень мелкие кусочки (микротомом), которые помещают между двумя стеклами, раздавливая мышечные волокна, и исследуют под микроскопом. В настоящее время для этой цели широко используются специальные микроскопы – трихинеллоскопы.

В случае трихинеллеза при трихинеллоскопии по ходу мышечных волокон обнаруживаются резко выделяющиеся овальной формы (похожие на лимон) трихинеллезные капсулы. Средняя величина капсул у человека составляет 0,4 х 0,26 мм. В капсуле, как правило, содержится одна спирально свернутая в 2,5 оборота трихинелла. При высокой интенсивности инвазии в одной капсуле может быть 2 или 3 личинки. Смежные с капсулой мышечные волокна теряют свою поперечную исчерченность и принимают гомогенный вид.

Таким же способом исследуют мясо или мясные продукты, явившиеся причиной заражения.

Метод переваривания мышц . Метод более эффективен.

Ход исследования. Исследуемые мышцы мелко измельчают и заливают искусственным желудочным соком в соотношении 1:15-20. Полученную смесь помещают в термостат при 37°С на 12-16 ч. По истечении этого срока микроскопируют осадок, в котором среди массы остатков переваренных мышечных волокон обнаруживаются личинки трихинелл в свободном состоянии.

Искусственный желудочный сок можно приобрести в аптеке или приготовить в лаборатории. Для этого к 1 л дистиллированной воды добавляют 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты; перед использованием к 1 л разведенной кислоты добавляют 30 г пепсина.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественные методы исследования применяются при определении интенсивности инвазии, оценке эффективности различных антигельминтных препаратов, определении качества дегельминтизации, контроле проводимых массовых лечебно-профилактических мероприятий и др.

Количественное определение яиц гельминтов проводится двумя методами: методом Столла и методом Красильникова и Волковой (1974).

Метод Столла . Для проведения исследования необходимо иметь микроскоп, стеклянную колбу с отметкой 56 и 60 мл, мерный цилиндр, стеклянные бусы, резиновую пробку для колбы, градуированные пипетки, предметные стекла и 0,4% раствор едкого натра.

Ход исследования. В колбу мерным цилиндром наливают децинормальный раствор едкого натра (примерно 0,4% концентрации) до метки 56 мл и добавляют испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет отметки 60 мл (т.е. 4 мл испражнений). Смесь тщательно взбалтывают со стеклянными бусами в течение 1 минуты, закрыв сосуд резиновой пробкой (можно перемешать и палочкой). Тотчас после взбалтывания набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси (в ней содержится 0,005 мл испражнений), переносят на предметное стекло и подсчитывают количество яиц в препарате под микроскопом. Чтобы определить количество яиц в 1 г испражнений, обнаруженное число умножают на 200.

Сравнение числа яиц в препарате, обнаруженное у больного до проведения лечения и после него позволяет судить об эффективности дегельминтизации.

Метод Столла прост, дает сравнимые результаты при всех гельминтозах, возбудители которых систематически выделяют яйца в кишечник больного. Однако недостатком метода является его относительно низкая чувствительность, особенно при слабой интенсивности инвазии.

Метод Красильникова-Волковой . При исследовании этим методом не менее 1 г фекалий смешивают в стеклянной колбочке или большой пробирке с 1% раствором "Лотоса" (или 1,5% раствором "Экстры") в соотношении 1:10. Взвесь тщательно взбалтывают до образования гомогенной суспензии, затем быстро набирают градуированной пипеткой 0,1 мл взвеси (что равняется 0,01 г фекалий) и переносят на предметное стекло. Препарат покрывают покровным стеклом или целлофановой пластинкой (20 х 30 мм), выдержанной не менее одних суток в 50% водном растворе глицерина.

Подсчитывают число яиц во всем препарате. Для расчета количества яиц в 1 г фекалий полученное число надо умножить на 100.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед методом Столла. Во-первых, он более чувствителен и позволяет выявлять гельминтов при слабой степени инвазии. Во-вторых, он очень удобен при массовых обследованиях, так как растворы детергентов, являясь консервантами яиц гельминтов, позволяют проводить исследования и не совсем свежего материала. Однако обязательным условием при этом является сбор фекалий непосредственно в раствор детергента.

Для количественного исследования можно применять любой из описанных унифицированных качественных методов, основанных на принципе всплывания яиц. Но в этом случае для анализа должно быть взято одно и то же количество фекалий, один и тот же объем флотационного раствора. Расчет степени инвазии можно произвести, зная количество яиц в 1 г фекалий, по приведенной таблице.

Интенсивность инвазии в зависимости от числа яиц гельминтов

в 1 г фекалий

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Эти методы, основанные на выявлении специфических антител в сыворотке крови, применяются с диагностической и скрининговой целями.

К серологическим методам относятся:

Реакция кольцепреципитации (РКП) (трихинеллез, цистицеркоз);

Реакция кольцепреципитации в пробирках на холоде (трихинеллез, цистицеркоз);

Реакция микропреципитации на живых личинках (трихинеллез, аскаридоз);

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) (трихинеллез, эхинококкоз, альвеококкоз, цистицеркоз и др.);

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) (эхинококкоз, альвеококкоз, трихинеллез, тениаринхоз и др.);

Реакция связывания комплемента (РСК) (трихинеллез, эхинококкоз, цистицеркоз);

Реакция энзим-меченных антител (РЭМА) (эхинококкоз, онхоцеркоз, шистосомозы, трихинеллез, токсокароз);

Иммуноферментный анализ (ИФА) (трихинеллез, описторхоз, токсокароз, токсоплазмоз и др.).

Для постановки серологических реакций выпускаются стандартные антигены или же они готовятся самостоятельно (например, из эхинококковых пузырей овец), выпускаются специальные тест-системы для ИФА.

Специальные методы исследования на энтеробиоз, тениаринхоз, тениоз

Соскоб с перианальных складок . Для получения соскоба с перианальных складок можно применять деревянный шпатель, целлофановую полоску, целлюлозную бумагу или ленту, глазные палочки со специальным клеевым слоем:

а) соскоб деревянным шпателем (шпатель – уплощенная спичка или палочка), смоченным 1% раствором глицерина (или 0,5% раствором питьевой соды), производится легким соскабливанием с поверхности перианальных складок по всей окружности анального отверстия. Полученный соскоб переносят краем покровного стекла с конца шпателя на предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина, накрывают этим же покровным стеклом и микроскопируют. Недостатком метода является недостаточная выявляемость яиц и раздражающее действие;

б) по методу Торгушина делают смыв ватным тампоном на деревянном или другом шпателе, смоченном 50% раствором глицерина, и готовят мазок на предметном стекле в капле глицерина;

в) по методу Кеворковой в центрифужную пробирку наливают около 5 мл кипяченой воды, помещают в него шпатель (палочку) с ватным тампоном. Перед взятием материала тампон слегка отжимают о внутреннюю стенку пробирки, обтирают им перианальные складки и вкладывают шпатель с тампоном в пробирку. Тщательно взбалтывают тампон в пробирке, смыв центрифугируют 3 мин и полученный осадок исследуют под микроскопом;

г) соскоб липкой лентой по Грэхэм. Часть липкой ленты (прозрачная полиэтиленовая лента с липким слоем для детского творчества, но лучше использовать операционную пленку ЛПО-1, ЛПО-2) длиной 8-10 см приклеивают липким слоем к перианальным складкам кожи, держа за концы, а затем переносят ее на предметное стекло липким слоем вниз (концы ленты, выходящие за края стекла отрезают), стекла нумеруются, а в журнале записываются данные больного и номер стекла. В лаборатории ленту с одного конца отклеивают на большом протяжении, капают под нее 1-2 капли вазелинового масла или глицерина (для устранения оптических дефектов) и микроскопируют;

д) соскоб с помощью стеклянных глазных палочек, поверхность которых покрыта специльным клеевым составом. Глазные палочки устанавливаются в специальный штатив. Забор материала производится путем соприкосновения плоской части лопаточки к коже перианального отверстия. Затем палочка снова укрепляется в штатив для транспортировки. Микроскопия проводится непосредственно на лопаточке с обеих сторон (без предметных и покровных стекол) с предварительным креплением в кассеты при малом увеличении (окуляр х 10, объектив х 8). По окончании работы палочки дезинфицируются кипячением в мыльном растворе, а штатив и кассеты обрабатываются спиртом и промываются мыльно-содовым раствором. Состав клея: клеол – 10 г, касторовое масло – 2,5 г, этиловый эфир – 5 г, этиловый спирт 96% - 2,5 г.

Лопаточки обмакиваются в раствор клея, затем высушиваются на воздухе при комнатной температуре. Образовавшаяся на поверхности клейкая пленка сохраняется в течение нескольких дней.

Метод удобен при массовом обследовании детского населения на энтеробиоз и взрослого населения на тениидозы.

Дополнительно к методу соскоба при тениаринхозе и тениозе применяются также метод опроса и описанный выше макроскопический метод (при выявлении члеников).

Специальные методы исследования на стронгилоидоз

Применяют эфир-уксусный метод для обнаружения яиц (см. выше) и метод Бермана для обнаружения личинок в испражнениях.

Метод Бермана . Исследуют свежий кал, лучше после принятия слабительного. Пробу фекалий 5 г помещают на металлическое сито (сетку внутри выстилают двумя слоями марли) в стеклянную воронку, закрепленную в штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом (аппарат Бермана).

Сетку с испражнениями приподнимают и в воронку наливают нагретую до 40-50°С воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду и кал покрылся водой целиком. Через 2-4 ч зажим на резиновой трубке быстро открывают, и жидкость спускается в центрифужную пробирку. После центрифугирования (1-2 мин) верхнюю часть жидкости быстро сливают, а осадок в количестве 1 мл наносят тонким слоем на предметное стекло и микроскопируют под малым увеличением микроскопа.

Метод ИМП и ТМ . В химический стаканчик помещают порцию фекалий величиной с орех, заливают теплым 40°С физраствором, чтобы фекалии покрылись раствором, оставляют на 20 мин. Через 20 мин сливают жидкость в чашку Петри и просматривают под бинокулярным микроскопом МБС.

Для диагностики стронгилоидоза, особенно для контроля за эффективностью лечения, рекомендуется сочетать метод Бермана с исследованием дуоденального содержимого.

Специальные методы исследования на нематодозы

Нематозы

Аскаридоз

В анамнезе обращается внимание на отношение к огородничеству, садоводству. Употребление в пищу сырых овощей, салатов, приготовленных из этих овощей.

Клинические проявления ранней фазы аскаридоза обусловлены аллергическими перестройками организма. Ранняя или миграционная личиночная стадия аскаридоза протекает нередко при наличии лихорадки с температурой тела до 38° и выше, с симптомокомплексом поражения легких, наличием выраженной эозинофилии крови. В большинстве случаев у детей первыми признаками заболевания являются недомогание, слабость, периодические головные боли, потливость, иногда боли в мышцах, суставах. Нередко появляется обильная сыпь типа крапивницы с сильным или умеренным зудом. Диагноз ранней фазы подтверждается рентгенологическими исследованиями на наличие в легких летучих эозинофильных инфильтратов Леффлера. В мазках свежевыделенной мокроты нередко обнаруживаются эозинофильные клетки, эритроциты, кристаллы Шарко-Лейдена и личинки аскарид.

При кишечной имагинальной стадии аскаридоза отмечается сочетание проявлений со стороны желудочно-кишечного и астенического синдромов, энтероколитический болевой симптомы. У детей нередко отмечается снижение в весе, порой довольно значительно. Тошнота, повышенная саливация, раздражительность, задержка психомоторного развития, снижение интеллекта.

Для лабораторной диагностики кишечной ст

Испражнения исследуются двумя методами:

1. Макроскопический – обнаруживают гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы. Небольшие порции кала, перемешивают с водой в плоской ванночке или чашке Петри и просматривают при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой. Все подозрительные образования пинцетом переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина.

При методе отстаивания исследуемую порцию фекалий размешивают с водой в стеклянном цилиндре, после отстаивания сливают верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной ее сливают, а осадок просматривают в чашке Петри.

2. Микроскопический – для обнаружения яиц и личинок гельминтов. Существует много методов исследования.

1). Нативный мазок – наиболее распространенный и технически доступный метод исследования. Можно обнаружить яйца и личинки всех гельминтов. Однако, при небольшом количестве яиц их не всегда удается найти. Поэтому используется метод обогащения.

1). Метод Фюллеборга – это метод обогащения, основан на всплытии яиц гельминтозов в насыщенном растворе NaCl (1,2 – плотность; 400 г NaCl на 1 литр воды; 40% раствор NaCl). Метод более эффективен, чем нативный мазок. В стеклянные банки помещают 2-5 г фекалий и заливают раствором NaCl, размешивают и через 45 минут снимают образовавшуюся пленку металлической петлей, помещают каплю глицерина на предметное стекло. Исследуют под микроскопом. Недостаток метода – замедленное высплывание яиц различных гельминтов, карликовый цепень – через15-20 минут, аскарид – 1,5 часа, власоглав – 2-3 часа.

2) Метод Калантарян – также метод обогащения, но применяется насыщенный раствор NaNO 3 (1,38 плотность). Большинство яиц всплывает, не требуется исследования осадка. Недостаток – длительное выдерживание яиц в растворе, приводит к тому, что некоторые яйца начинают набухать и оседать на дно, исчезая с поверхностной пленки.

3. Метод Горячева – основан на принципе осаждения яиц, обнаружения мелких яиц трематод. В качестве раствора используют насыщенный раствор NaCl и сверху осторожно наслаивают 3-4 мл раствора фекалий. Через 15-20 часов яйца трематод оседают на дно. Жидкость сливают, осадок на предметное стекло и под микроскоп.

4. Метод закручивания по Шульману – для обнаружения в кале личинок гельминтов. Исследуют только свежевыделенные фекалии. 2-3 г помещают в стеклянную банку и приливают 5-кратное количество воды, быстро размешивают палочкой, не касаясь стенок банки – 20-30 минут, затем палочку быстро вынимают, и каплю жидкости на конце переносят на предметное стекло и микроскопируют.

5. Метод Бермана – основан на способности, личинок гельминтов мигрировать, по направлению к теплу, и служит для выявления их в фекалиях.

6. Метод Харада и Мори (метод выращивания личинок) и рекомендуется для исследования на анкилостомитозы. Метод основан на том, что в тепле и на влажной фильтрованной бумаге из яиц анкилостомид развиваются филяриевидные личинки, которые легко можно обнаружить. На середину полоски фильтрованной бумаги наносят 15 г кала, бумагу с фекалиями помещают в банку, так, чтобы нижний конец был погружен в воду, а верхний закреплен пробкой. Банку выдерживают в термостате 28 0 С в течение 5-6 дней. Филяриевидные личинки развиваются за это время и спускаются в воду. Жидкость исследуют под лупой. Если трудно обнаружить, жидкость центрифугируют, убив предварительно личинок нагреванием до 60 0 . Лаборант должен работать в перчатках.

7. Методы на энтеробиоз – выявление яиц острицы и бычьего цепня.

а) соскоб с перианальных складок – ватным тампоном, туго намотанным на деревянную палочку и смоченную 50% раствором глицерина. В лаборатории тампон смывают 1-2 каплями 50% водным раствором глицерина.

б) метод липкой лепты (метод Грэхэма)

Липкую ленту прикладывают к перианальным складкам, затем липким слоем к предметному стеклу и микроскопируют.

В) соскоб с помощью глазных палочек (метод Рабиновича). Для перианального соскоба используют стеклянные глазные палочки, широкая часть которых покрывается специальным клеем, что позволяет удерживать яйца остриц.

Исследование крови, желчи, мокроты и мышц

Микроскопия крови – обнаруживают личинки филярий.

Исследование мокроты – яйца параганима, личинки аскариды, некатора, стронгилоида, элементы эхинококкового пузыря.

Исследование мышц – при подозрении на трихинеллез исследуют мышцы больного или трупа, а также мясо, предположительно послужившего причиной заражения человека. С целью трихинеллоскопии мышцу разрезают на мелкие кусочки и помещают в компрессорий, это два широких, толстых стекла, которые раздавливают мышцы и личинки трихинеллы обнаруживаются в виде капсул – метод компрессии.

Метод переваривания – мышцы заливают искусственным желудочным соком (раствор соляной кислоты и пепсин). Мышцы перевариваются, а личинки легко выявляются. Определение интенсивности инвазии: количество личинок до 200 на 1 г мышечной ткани – умеренная интенсивность инвазии; до 500 – интенсивная; свыше 500 – сверхинтенсивная инвазия.

Серологические методы

Медицинское значение имеют три группы гельминтов-нематоды (круглые черви), цестоды (ленточные черви) и трематоды (сосальщики).

Для видовой идентификации яиц гельминтов используются следующие признаки.

1. Размеры . Измеряют длину и ширину яиц, которые обычно имеют определенную у каждого вида величину.

2. Форма . Для каждого вида характерна своя особая форма яиц.

3. Стадия развития при выделении во внешнюю среду . У одних Видов яйца состоят из одной клетки; у других в яйце может быть несколько клеток; у третьих яйца обычно эмбрионированы (т.е. они содержат личинки) при выделении с фекалиями во внешнюю среду. Иногда, если пробы фекалий исследуют через несколько часов или спустя 1-2 дня после дефекации, яйца гельминтов развиваются до более взрослых стадий. В идеале на анализ следует принимать только свежие пробы фекалий.

4. Толщина оболочки яйца. Яйца некоторых видов, например аскарид, имеют толстую оболочку; у других видов гельминтов, например у анкилостомид, оболочка яиц тонкая.

6. Наличие морфологических особенностей , таких, как крышки, шипы, пробки, крючочки или фестончатая наружная оболочка.

При обнаружении яйца гельминта или похожего на него объекта следует тщательно оценить все перечисленные выше признаки, чтобы установить видовой диагноз.

Для того чтобы установить видовую принадлежность яиц гельминтов, необходимо определить их размер, форму, стадию развития, толщину оболочки, цвет и наличие морфологических особенностей, таких, как крышечки, шипы, пробки, крючочки и бугристая наружная оболочка.

Для установления видового диагноза используют специальные определители и схематические изображения яиц гельминтов.

Рис. 34.2. Относительная величина, форма и структура яиц гельминтов.

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПРАЖНЕНИЙ.

Гельминтологические исследования проводятся с целью диагностики гельминтозов путем обнаружения в патологическом материале яиц, личинок, взрослых гельминтов или их фрагментов. Поскольку большинство гельминтов в половозрелой стадии развития находится в желудочно-кишечном тракте или в сообщающихся с ним органах, чаще всего применяются макро- и микрогельминтоскопические методы исследования фекалий (не более суточной давности).

С целью повышения достоверности обследования анализы должны быть повторены несколько раз ежедневно с промежутком 1-3 дня.

1.1. МАКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИСПРАЖНЕНИЙ

Метод отстаивания . Суточную порцию фекалий тщательно промывают водой, пока вода над осадком не станет прозрачной. Слив верхний слой, переносят осадок в чашку Петри и на темном фоне просматривают его под лупой или невооруженным глазом.

Метод отсеивания. Перемешанные с водой фекалии помещают на систему сит специального прибора. После промывания водопроводной водой сита переворачивают и, смыв содержимое в чашки Петри, просматривают невооруженным глазом или под лупой.

1.2. МИКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используют гельминтоовоскопические и гельминтоларвоскопические методы с целью обнаружения яиц гельминтов и их личинок.

1.2.1. ГЕЛЬМИНТООВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

При использовании гельминтоовоскопических методов обнаружения гельминтов вначале готовят двоякого рода мазки – нативный и толстый .

Þ Нативный мазок. Небольшое количество фекалий растирают на предметном стекле в капле 50%-ного раствора глицерина или кипяченой воды. Крупные частицы осторожно удаляют, смесь накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (просматривают два мазка).

Делая нативный мазок, следует знать, что при слабых инвазиях в нем редко обнаруживаются яйца гельминтов.

Þ Толстый мазок с целлофаном по Като. Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Подготовленный толстый мазок фекалий покрывают кусочком целлофана, смоченного смесью глицерин-фенол влажного целлофана. Препарат исследуют через 30–60 мин, когда он слегка подсохнет и просветлится, вследствие чего яйца гельминтов легко обнаружатся под малым увеличением микроскопа.

В большом мазке хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже – прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден.

Þ Методы обогащения

Среди методов обогащения используют методы флотации (всплывания) и седиментации (осаждения).

А). Методы флотации основаны на применении насыщенных растворов различных химических веществ, в которых яйца всплывают благодаря разнице удельного веса.

Метод всплывания по Фюллеборну основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия (удельный вес 1,18), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка. Достоинствами является доступность и дешевизна. Данный метод хорошо выявляет яйца нематод и карликового цепня.

Однако яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Поэтому требуется обязательно исследовать не только поверхностную пленку, но и осадок, что усложняет метод. К недостаткам относится и замедленное всплывание яиц: яйца карликового цепня всплывают через 15-20 мин, аскарид – через 1,5-2 часа, власоглава – через 2-3 часа.

Метод Е.В.Калантарян также метод обогащения, но более эффективен и проще. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностно пленке, исследование осадка не требуются.

Недостаток метода – дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке.

Б). Метод осаждения (седиментации) яиц гельминтов основаны на использовании химических веществ, растворяющих жиры и белки фекалий.

Метод П.П.Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод.

Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метода Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуются методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.

1.2.2. ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (выявление личинок)

Метод закручивания по Е.С.Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоидов . Исследуют только свежевыделенные фекалии, которые размешивают палочкой в 5-кратном количестве воды. Через 20-30 ск после начала размешивания палочку быстро вынимают, образовавшуюся на ее конце каплю жидкости переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Берманна основан на способности личинок гельминтов мигрировать по направлению к теплу и служит для их выявления в фекалиях, в первую очередь при подозрении на стронгилоидоз.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДРУГИХ ЭКСКРЕТОВ И СЕКРЕТОВ

В дуоденальном содержимом микроскопируют имеющиеся в нем хлопья и плотные включения, а затем, разлив его по пробиркам, добавляют равный объем серного эфира, центрифугируют и исследуют осадок.

В рвотных массах изредка обнаруживаются гельминты или их фрагменты (например, при прорыве нагноившейся эхинококковой кисты из легкого в бронхи с рвотой выделяется светлая водянистая или гнойная жидкость). Диагноз ставится на основании обнаружения обрывков кутикулярной оболочки, сколексов и крючьев эхинококка.

Исследование мочи.

Мочеполовой шистосомоз диагностируют путем выявления яиц и мирацидиев. Яйца возбудителя мочеполового шистосомоза (Schistosoma haemotobium) крупные и достигают в длину 120-150 мкм, они имеют терминальный шип на одном конце. Внутри яйца можно увидеть зародыш (мирацидий). Иногда возникает необходимость установить, являются ли обнаруженные яйца жизнеспособными. Это можно определить, если препарат свежий и к нему не добавлялись консерванты. При хронической форме шистосомоза у больных к концу мочеиспускания выделяется кровь, но яйца в моче находят редко, вследствие чего рекомендуется прибегать к биопсии мочевого пузыря.

Яйца парагонимуса, обитающего преимущественно в легких, в случае локализации в почке, мочеточниках, стенках мочевого пузыря попадают в мочу. В хилезной моче выявляются микрофилярии.

Исследование мокроты.

В мокро те могут находиться яйца парагонимусов, шистосом, личинки мигрирующих нематод, фрагменты эхинококкового пузыря. При некоторых гельминтозах в мокроте наблюдаются характерные изменения. При парагонимозе , например, в мокроте можно обнаружить скопления яиц в виде желтоватых комочков.

Отбор проб и их консервирование

Для исследования берут фекалии из разных мест порциями в количестве 50 г и в чистой стеклянной или пластмассовой посуде с плотной крышкой направляют в лабораторию. Исследованию подвергаются свежие фекалии (не более суточной давности), а в некоторых случаях (при исследовании на стронгилоидоз) сразу после дефекации. Предложен ряд консервантов фекалий, содержащих яйца гельминтов: 4-10% раствор формалина, который для предупреждения развития яиц анкилостомид необходимо подогреть до t° 50-60°; смесь 0,2% водного раствора азотнокислого натрия (1900 мл), раствора Люголя (5 г йода, 10 г йодистого калия, 250 мл воды), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл), в к-рой яйца гельминтов сохраняются 6-8 мес.; смесь глицерина (5 мл), формалина (5 мл) и воды (100 мл); растворы 1-1,5% детергентов «Лотос», «Экстра», «Барф», «Тайд» и т. д. (в весовом соотношении фекалий и раствора детергента 1: 5); смесь мертиолата 1: 1000 (200 мл), формалина (25 мл), глицерина (5 мл), дистиллированной воды (250 мл) с добавлением 0,6 мл раствора Люголя (из расчета 1 г фекалий на 10 мл смеси).

Для диагностики гельминтозов применяются макро- и микрогельминтоскопические методы исследования фекалий.

Макрогельминтоскопические исследования

Метод отстаивания

Суточную порцию фекалий тщательно перемешивают с 5-10-кратным количеством воды, сливают в высокие стеклянные цилиндры (банки, ведра) и оставляют до полного осаждения взвешенных частиц. Верхний мутный слой осторожно сливают и доливают чистую воду доверху (повторяют несколько раз, пока вода над осадком не станет прозрачной). Слив верхний слой, переносят осадок в кювету или чашку Петри и просматривают его (на темном фоне) под лупой или невооруженным глазом.

Метод отсеивания

Перемешанные с водой фекалии помещают на верхнее сито прибора, состоящего из системы сит с отверстиями убывающего диаметра, прибор соединяют с водопроводной сетью и, открыв водопроводный кран, промывают, а вытекающую жидкость отводят в канализацию. Крупные гельминты остаются на верхнем сите, а более мелкие задерживаются на нижних. Сита переворачивают и, смыв содержимое в темные кюветы, просматривают невооруженным глазом или под лупой.

Микрогельминтоскопические исследования

Проводят с целью обнаружения яиц (гельминтоовоскопические методы - цветн. рис. 1) или личинок гельминтов (гельминтоларвоскопические методы).

Гельминтоовоскопические методы

Качественные методы без обогащения

Нативный мазок . Небольшое количество фекалий растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина или кипяченой воды. Крупные частицы осторожно удаляют, смесь покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (просматривают два мазка). Удобнее и проще готовить длинные мазки между двумя предметными стеклами. Нативный мазок применяют только в дополнение к методам обогащения, т. к. он недостаточно эффективен, особенно при слабых инвазиях.

Толстый мазок с целлофаном по Като (К. Kato, 1954) является весьма эффективным методом исследования. Кусочки гидрофильного целлофана (размером 4x2 см) замачивают на 24 часа в смеси глицерина (50 мл), 6% раствора фенола (500 мл) и 3% водного раствора (6 мл) зеленой малахитовой (последняя не обязательна). Ок. 100 мг фекалий размазывают на предметном стекле и, покрыв кусочком влажного целлофана, придавливают резиновой пробкой № 5. Препарат исследуют через 30-60 мин., когда он слегка подсохнет и просветлится, вследствие чего яйца гельминтов легко обнаружить под малым увеличением микроскопа.

Качественные методы с обогащением (методы всплывания и осаждения)

Первые основаны на применении насыщенных растворов различных хим. веществ, в которых яйца всплывают благодаря разнице удельного веса.

Метод Кофоида-Барбера (Ch.А. Kofoid, М. A. Barber) в модификации Фюллеборна (F. Fulleborn, 1920). Ок. 5 г фекалий в высокой и узкой баночке (объемом 100 мл) размешивают деревянной палочкой в 100 мл насыщенного раствора поваренной соли, уд. вес к-рого 1,18 (400 г соли растворяют при кипячении в 1 л воды). Всплывшие на поверхность крупные частицы быстро удаляют палочкой или кусочком бумаги. После отстаивания смеси в течение 45-90 мин. проволочной петлей (диам. 0,8-1 см) снимают всю поверхностную пленку, переносят ее на предметное стекло. При исследовании на яйца анкилостомид смесь отстаивают 10-15 мин. Можно снимать пленку непосредственно предметным стеклом, к-рым покрывают баночку так, чтобы оно соприкасалось с жидкостью (насыщенный раствор соли доливают до краев баночки). После отстаивания предметное стекло снимают, быстро переворачивают и исследуют под микроскопом (без покровного стекла) приставшую к нему пленку с яйцами гельминтов. Этот метод хорошо выявляет яйца всех нематод и карликового цепня. Тяжелые яйца трематод; большинства цестод и неоплодотворенных аскарид всплывают плохо, поэтому исследуют и осадок. Для этого после снятия пленки жидкость из баночки быстро сливают и из осадка петлей или пипеткой берут несколько капель, переносят их на предметное стекло, добавляют каплю глицерина для просветления и исследуют под микроскопом.

Метод Е. В. Калантарян (1938) Является более эффективной модификацией метода Фюллеборна. В нем раствор поваренной соли заменен насыщенным раствором азотнокислого натрия, уд. вес к-рого 1,39 (один объем азотнокислого натрия растворяют в равном объеме воды при кипячении), пленку снимают через 20-30 мин.

Применяются также методы Фауста (Е. С. Faust, 1939), Брудастова с соавт. (1970) и др.

Для осаждения яиц гельминтов используют хим. вещества, растворяющие жиры и белки фекалий.

Метод Телеманна (W. Telemann, 1908) в модификации Миягавы (Y. Miyagawa, 1913) . Ок. 5 г фекалий растирают в ступке или баночке, добавив по 5 мл этилового эфира и 50% раствора соляной к-ты; смесь процеживают через проволочное или волосяное сито в пробирку и центрифугируют. В пробирке образуется 3 слоя: вверху - эфир с растворенным жиром, ниже - соляная к-та с растворенными белковыми веществами, в осадке - нерастворимые части фекалий и яйца гельминтов. Верхние слои сливают, а к осадку добавляют воду и центрифугируют. Несколько капель осадка переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Этим методом можно обнаружить яйца всех видов гельминтов, но они иногда деформируются.

Метод Ритчи (L. S. Kitchie, 1948). Для растворения жиров и белков используют формалин и эфир.

Для осаждения яиц гельминтов можно применять различные детергенты. За рубежом получил распространение метод фильтрации в специальных аппаратах Белла, который применяется для исследований не только фекалий, но и мочи, крови и т. д.

Существует ряд методов, сочетающих принципы флотации и осаждения яиц. К их числу относятся методы Лейна (С. A. Lane), Риваса (D. Rivas), Горкиной, Дарлинга (S. Т. Darling). Один из таких флотационно-седиментационных методов, а также метод последовательных сливов предложены Н. В. Демидовым (1963, 1965) для исследования на фасциолез и дикроцелиоз.

Количественные методы

Метод Столла (N. R. Stoll, 1926). В градуированную широкую пробирку или колбочку (с двумя метками: 56 и 60 мл) наливают до первой метки децинормальный раствор едкого натра, добавляют фекалии до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет второй метки, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и, поместив 10 стеклянных бусинок или мелких камешков, закрывают пробкой и встряхивают в течение 1 мин. Быстро, чтобы взвесь не отстоялась, набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси (0,005 г фекалий), переносят на предметное стекло с нанесенной на нем сеткой, покрывают покровным стеклом и подсчитывают под микроскопом яйца гельминтов в препарате; умножив полученное число на 200, получают количество яиц в 1 г фекалий. Для более точного результата подсчитывают яйца в двух или более препаратах и берут средний показатель. Метод Столла нечувствителен при слабых инвазиях. Поэтому рекомендуют подсчитывать число яиц в препаратах, приготовленных различными методами флотации или осаждения, при условии постоянного использования равной навески фекалий и посуды одного объема. Используют также толстый мазок по Като.

Метод Бивера (Р. С. Beaver, 1950). Готовят стандартный мазок, густоту к-рого определяют при помощи электрофотометра, а затем подсчитывают в нем все яйца гельминтов.

Гельминтоларвоскопические методы

Метод Берманна (G. Baermann, 1917). 5-10 г свежевыделенных фекалий помещают на металлической сетке в стеклянную воронку, на узком конце к-рой надета резиновая трубка с зажимом. Во избежание загрязнения осадка частицами кала рекомендуется подкладывать (на сетку) бумагу или добавлять в фекалии животный уголь или кукурузную муку. Воронку наполняют теплой водой (t° 45-50°) до соприкосновения с фекалиями. В силу термотропности личинки активно перемещаются в теплую воду и постепенно скапливаются в нижней части воронки, над зажимом. Через 3-4 часа зажим открывают, жидкость спускают в 1-2 пробирки, центрифугируют в течение 2-3 мин., верхний слой сливают, а осадок исследуют на предметном стекле под микроскопом.

Метод выявления мирацидиев шистосом. Фекалии промывают в темноте при t° 8-10°, осадок выдерживают 45 мин. на ярком свете при t° 28°, затем переливают в темную колбу с трубочкой сбоку. Мирацидии концентрируются в прозрачной боковой трубке, откуда их можно выбрать.

Для выявления личинок анкилостом применяют также методы Фюллеборна и др.

Методы исследования других выделений, а также тканей и органов

Ок. 100 мл исследуемой мочи отстаивают 30 мин. в цилиндре и, удалив верхний слой, сливают 10- 15 мл осадка в пробирку, центрифугируют при 1500 об I мин в течение 1-2 мин.; осадок исследуют. Желательно собирать всю суточную порцию мочи.

Моче-половой шистосоматоз диагностируют путем выявления мирацидиев. Порцию свежей мочи центрифугируют в течение 5 мин., осадок переливают в окрашенную в черный цвет колбу, к верхней части к-рой припаяна прозрачная стеклянная трубочка. Добавляют воду в соотношении 1:5, 1: 10 и ставят на 2 часа в термостат при t° 25-30°. Вышедшие из яиц мирацидии видны через прозрачную трубочку невооруженным глазом в виде быстро движущихся точек. При хрон, форме шистосоматоза у больных к концу мочеиспускания выделяется кровь, но яйца в моче находят редко, поэтому рекомендуется прибегать к биопсии мочевого пузыря.

Исследование мокроты. В мокроте могут находиться яйца парагонимусов, шистосом, томинксов, личинки мигрирующих нематод, фрагменты эхинококкового пузыря. Всю доставленную порцию мокроты тщательно просматривают невооруженным глазом или под лупой, выбирают и исследуют все видимые обрывки тканей, скопления ржавого цвета и пр.; затем просматривают всю порцию мазками. Гнойную мокроту заливают равным количеством 0,5% раствора едкой щелочи, центрифугируют и исследуют осадок.

При некоторых гельминтозах в мокроте наблюдаются характерные изменения. При парагонимозе, напр., в мокроте можно обнаружить скопления яиц в виде желтоватых комочков, а также большое количество слизи, лейкоциты, эритроциты, альвеолярные клетки, спирали Куршманна, эластические волокна, кристаллы Шарко-Лейдена. Выявлены также характерные ромбовидные кристаллы с заостренными концами. Наличие большого числа эозинофилов позволяет дифференцировать парагонимоз от туберкулеза.

Исследование содержимого абсцессов и пунктатов . В гнойных выделениях абсцессов, а также в опухолях и кистах, удаленных при оперативном вмешательстве, можно обнаружить гельминтов, их фрагменты, личинки и яйца (эхинококк, альвеококк, спарганум, цистицерк, дирофилярия, аскариды, токсокара, парагонимус и др.). Техника исследования обычная; в некоторых случаях из тканей опухоли готовят гистологические срезы. Гнойное содержимое можно обработать методом Телеманна; прозрачную жидкость исследуют также, как и дуоденальное содержимое, добавляя серный эфир. Эхинококковую жидкость центрифугируют и исследуют осадок на наличие сколексов и крючьев; препараты окрашивают карболфуксином по Цилю-Нельсену.

Исследование крови. В крови обнаруживают микрофилярий и личинок мигрирующих нематод. Каплю крови берут из пальца или из мочки уха и исследуют в свежем виде или готовят из нее препараты.

Каплю крови помещают на предметное стекло с нанесенным квадратом из вазелина и слегка прижимают покровным стеклом. Под микроскопом видны микрофилярии, двигающиеся между клетками крови. Кровь можно помещать между двумя слоями клейкой целлюлозной ленты; микрофилярии сохраняют подвижность в течение 6 час.; в полностью высохшем препарате их можно различить под микроскопом в течение 30 дней. Идентифицировать виды микрофилярий можно лишь в окрашенных мазках или толстых каплях. Приготовленные препараты высушивают, гемолизируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе, Райту, Цилю-Нельсену, Лейшману, Папаниколау (см. Райта метод окраски, Романовского-Гимзы метод, Циля-Нельсена метод). Обнаружив микрофилярий в капле крови, окрашенной по Романовскому-Гимзе, препарат дополнительно окрашивают гематоксилином Хансена; через 15-60 мин. промывают 2 мин. в проточной воде. Перекрашенный препарат дифференцируют в 0,2% растворе соляной к-ты; чехлик микрофилярий окрашивается в бледнофиолетовый цвет, а ядерная субстанция тела - в темно-фиолетовый.

При слабых инвазиях необходимо исследовать 2-10 лед крови с анти-коагулянтом (напр., с 5% раствором лимоннокислого натрия) одним из следующих методов.

Метод Кнотта (J. Knott, 1939), модифицированный Маркеллом и Фоге (Е. К. Markell, М. Voge, 1965). 2 мл крови перемешивают в центрифужной пробирке с 10 дел 1% уксусной к-ты, центрифугируют в течение 2 мин. при 1500 об/мин; поверхностный слой сливают, осадок распределяют на нескольких предметных стеклах и исследуют под микроскопом. Препараты можно окрашивать по Романовскому-Гимзе или другими методами.

Метод фильтрации Белла (D. R. Bell, 1967). В аппарате, состоящем из воронки из нержавеющей стали с прямоугольным отверстием и мембранных фильтров той же формы, размером 19 х 42 мм, с величиной пор от 0,8 до 5 мкм, фильтруют в пробирки кровь, гемолизированную в смеси из 1 мл детергента типола и 9 мл физиол, раствора (для ускорения фильтрации аппарат соединен с вакуумным насосом). Фильтр фиксируют в кипящей дистиллированной воде и окрашивают по Романовскому-Гимзе или горячим гематоксилином Эрлиха. Окрашенный фильтр высушивают в эксикаторе или в изопропиловом спирте (последовательно в 3 чашках), просветляют на стекле иммерсионным маслом и исследуют под покровным стеклом. Окрашенные препараты сохраняются несколько недель. Метод Белла наиболее эффективен для количественного учета микрофилярий в крови.

Применяется также метод с поливидоном Голдсмида.

Исследование кожи. В коже можно обнаружить микрофилярий онхо-церков и личинок гельминтов животных, вызывающих кожную форму larva migrans (см.). Срезы кожи или материал, полученный скарификацией, берут в области бедра, икры, ягодицы или на уровне дельтовидной мышцы. Конусообразный кусочек эпидермиса поднимают энтомологической булавкой и, срезав бритвой, исследуют на стекле в капле физиол, раствора. При отрицательном результате свежий препарат повторно просматривают через 10 мин.; личинки обычно локализуются по краям препарата. Полученный материал можно выдерживать в 2 мл физиол, раствора в течение 1-2 час. и исследовать осадок. Рекомендуют брать у больного 5 срезов кожи.

Можно готовить препараты и из крови и тканевой жидкости, выделившихся после сильного сжатия срезов. Капли окрашивают по Майеру, Романовскому-Гимзе или гематоксилином Делафильда.

Стандартный метод количественного учета инвазии. Биопсированный участок кожи диам. 3-5 мм и весом не менее 1-4 мг взвесить, разрезать на мелкие кусочки и подсчитать личинки под микроскопом в физиол. растворе на предметном стекле; 1-4 личинки в поле зрения обозначают знаком +, 5-9 личинок - знаком ++ , 10-19 - знаком +++, 20 и более - знаком + + + +. Количественный учет удобнее проводить на окрашенных препаратах.

Исследование на трихинеллез, цистицеркоз и Шистосоматозы

Выявление личинок трихинелл

Компрессионный метод. Кусочек двуглавой или икроножной мышцы (вблизи сухожилия), взятой хирургическим путем с соблюдением асептики, расщепляют препаровальными иглами на отдельные тонкие волоконца, сдавливают их между двумя предметными стеклами в капле глицерина так, чтобы препарат был тонким и прозрачным. Под микроскопом с затемненным полем зрения хорошо видны личинки трихинелл. Эффективно исследование нескольких кусочков мышц в компрессориумах, используемых в вет.-сан. практике, особенно в специальных трихинеллоскопах.

Метод переваривания Бечмена (G. W. Bachman, 1928). 1 а измельченных мышц заливают 60 мл искусственного желудочного сока (0,5 г пепсина; 0,7 мл концентрированной соляной к-ты; 100 мл воды) и выдерживают 18 час. в термостате при t° 37°; верхний слой жидкости сливают, к осадку добавляют теплой воды (t° 37-45°) и выливают в аппарат Берманна. Через час жид-, кость спускают в пробирку, центрифугируют и исследуют осадок. Если личинки заключены в обызвествленные капсулы, их предварительно декальцинируют в растворе соляной, азотной, или серной к-ты.

Биопроба . Кусочки исследуемых мышц скармливают белым мышам или крысам. Через 2-3 дня можно обнаружить половозрелых трихинелл в дуоденальном содержимом, а через 2-3 нед.- личинок в мышцах диафрагмы и языка.

Гистологические срезы. Кусочки мышц фиксируют в жидкости Буэна, Ценкера или др.; обычным способом готовят срезы на микротоме и окрашивают их гематоксилином Делафильда.

Выявление цистицерков

Кусочек экстирпированной мышцы, соединительной ткани и пр. осматривают невооруженным глазом, осторожно выделяют цистицерк - беловатый полупрозрачный пузырек размером 1-2 см, раздавливают его между двумя предметными стеклами в капле глицерина и исследуют под микроскопом. Для определения жизнеспособности выделенных из тканей цистицерков их выдерживают в 50% растворе желчи на физиол. растворе в термостате при t° 37°; через 10-60 мин. головка жизнеспособного цистицерка выворачивается наружу. Обызвествленных цистицерков предварительно декальцинируют 4% раствором азотной к-ты в течение часа.

Выявление яиц шистосом

При хрон, формах шистосоматозов, когда образование гранулем препятствует выходу яиц из тканей в просвет кишечника или в мочевыводящие пути, применяют биопсию слизистой оболочки прямой кишки, к-рую производят специальной ложкой при помощи ректоскопа, выбирая участок с видимым поражением. Биопсированный кусочек раздавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под микроскопом. При отрицательном результате кусочки просветляют в 4% растворе едкой щелочи и готовят из них гистол. срезы. Биопсию слизистой оболочки тощей кишки производят перорально и полученный материал исследуют комперссионным методом или готовят из него гистол, срезы. В ряде случаев моче-полового шистосоматоза диагноз может быть поставлен только на основании эндовезикальной биопсии. При гепатолиенальной форме шистосоматоза производят пункционную биопсию печени; из полученного материала готовят гистол, срезы и исследуют их под люминесцентным микроскопом. Люминесцентный микроскоп с темным полем использования и для исследования тканей печени на яйца шистосом. При поражении шистосомами женских половых путей выделения собирают при помощи влагалищного зеркала или берут острой ложечкой кусочки слизистой оболочки шейки матки; полученный материал исследуют под микроскопом на стекле в капле физиол, раствора.

Исследование на энтеробиоз и тениидозы

Перианальный соскоб (рекомендуется брать вечером, через 1 - 1,5 часа после того, как пациент лег спать, или утром до совершения туалета). Спичкой, срезанной наискось и смоченной в капле жидкости (физиол, раствор, кипяченая вода или 2% раствор двууглекислой соды), нанесенной на предметное стекло, осторожно делаю? соскоб со слизистой оболочки ануса и складок вокруг него (от центра кнаружи). Собранную на конце спички слизь счищают краем покровного стекла в каплю жидкости на предметном стекле и, покрыв этим же покровным стеклом, исследуют. При массовых обследованиях, когда соскобы берут в детских или других учреждениях, использованную спичку помещают в каплю жидкости на предметном стекле, после подсыхания капли покрывают другим предметным стеклом и доставляют в лабораторию, завернув в бумагу и закрепив резинкой. Для исследования ректальной слизи пользуются специальным прибором - трубочкой Шахматова или Циманна, с помощью которых берут слизь из прямой кишки и исследуют мазки под микроскопом.

Метод с ватным тампоном. Пациентам на дом выдают пробирку с ватным тампоном на стеклянной или деревянной палочке; утром пациент протирает перианальные складки тампоном, Смоченным кипяченой водой, и помещает его в пробирку с небольшим количеством воды. В лаборатории тампоны прополаскивают в той же пробирке с новой порцией воды и осадок исследуют после центрифугирования.

Целлофановый метод Холла (М. С. Hall, 1937). Квадратный кусочек целлофана укрепляют резинкой на стеклянной палочке. Соскоб делают сухим целлофаном и помещают его в пробирку. В лаборатории целлофан слегка сдвигают с палочки и, срезав его кончик ножницами, расправляют на предметном стекле; смочив децинормальным раствором едкого натра, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

Метод с целлюлозной лентой Грэма (С. F. Graham, 1941). Полоску целлюлозной ленты прижимают клейкой стороной к перианаль-ным складкам обследуемого, затем той же стороной к предметному стеклу и исследуют без покровного стекла; можно добавлять каплю толуена. В. В. Каледин (1972) для этих целей предложил применять целлулоидные диски, вырезанные из отмытой рентгеновской пленки и смоченные глицерином; диски исследуют на предметном стекле в капле силикатного клея. Методом с целлюлозной лентой можно исследовать также нательное белье детей.

Подногтевой соскоб. Края ногтя, ногтевое ложе, подногтевые пространства смачивают 0,5-1% раствором едкой щелочи и протирают влажными ватными тампончиками. Тампоны помещают в центрифужные пробирки с этим же раствором, центрифугируют и исследуют осадок.

Методы исследования объектов окружающей среды на яйца и личинки гельминтов (санитарно-гельминтологические исследования)

Исследования проводят с целью определения степени загрязненности яйцами и личинками гельминтов объектов внешней среды. Полученные данные используют для оценки сан. состояния учреждений и предприятий и эффективности проводимых мероприятий по борьбе с гельминтозами.

При изучении степени загрязненности различных объектов окружающей среды яйцами и личинками гельминтов и оценки их роли в эпидемиологии гельминтозов важно установить не только число найденных яиц, но и их жизнеспособность и инвазионность, которые определяют: а) по внешнему виду, под микроскопом; б) окрашиванием различными красителями, в т. ч. люминесцентными; как правило, живые яйца и личинки не окрашиваются; в) культивированием в оптимальных условиях до инвазионной стадии; г) заражением лабораторных животных (биопроба).

Исследования воды и канализационных стоков. Для одного исследования используют 10-25 л воды (рек, морей, прудов, купальных бассейнов, водопровода) и 1-2-5 л канализационных стоков.

Метод 3. Г. Васильковой (1941). Воду или канализационные стоки фильтруют через мембранные ультрафильтры в аппарате Гольдмана, состоящем из стеклянной или металлической воронки с фильтрами, соединенной при помощи кольца-насадки с колбой Бунзена. Для ускорения процесса фильтрации к аппарату подключают вакуумный насос. После фильтрации мембранные фильтры просматривают под микроскопом, просветлив их 50% раствором глицерина; скопившийся осадок счищают и просматривают отдельно в виде мазков. Применяются фильтровальные аппараты и других конструкций.

Метод Г. Ш. Гуджабидзе и Г. А. Юдина (1963) для исследования канализационной жидкости. 1 л жидкости отстаивают 2 часа в цилиндре Лисенко; полученный осадок (5-9 мл) обрабатывают, как при исследовании почвы (см. ниже).

Метод Н. А. Романенко (1967). К 1л сточной жидкости, помещенной в стеклянный цилиндр емкостью 1200-1500 мл, добавляют 0,4-0,6 г сернокислого алюминия или хлорного железа (с целью коагулирования, ускоряющего процесс осаждения взвешенных частиц) и через 40 мин. смесь центрифугируют 3 мин. при 1000 об/мин; верхний слой сливают, а для растворения хлопьев добавляют 1-2 мл 3% раствора соляной к-ты, затем 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия. Осадок исследуют, как почву.

Исследование почвы

Загрязненность почвы яйцами гельминтов определяют с целью выявления очагов гельминтозов и оценки эффективности работы по их оздоровлению.

Метод 3. Г. Васильковой и В. А. Гефтер (1948). 12,5 г почвы смешивают в пробирках (объемом 100 мл) из нержавеющей стали или латуни с 20 мл 5% раствора едкой щелочи, добавив 10 стеклянных бусинок или мелких камешков. Пробирки закрывают резиновыми пробками и встряхивают в течение 20 мин. в аппарате для встряхивания или вручную. Вынув пробки, пробирки центрифугируют 3-5 мин., поверхностную жидкость сливают, к осадку добавляют 60-80 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия и, тщательно перемешав, вновь центрифугируют 3-5 мин. В сю поверхностную пленку со всплывшими яйцами снимают, прикасаясь к поверхности смеси сложной петлей (5-6 петель, соединенных на общем стержне), и переносят в стаканчик с водой; перемешивают с тем же раствором, центрифугируют; всю процедуру повторяют не менее 3 раз. Содержимое стаканчика, куда переносят пленку, разбавляют водой и фильтруют через мембранные фильтры, которые исследуют под микроскопом в капле глицерина.

Метод 3. Г. Васильковой и В. А. Гефтер в модификации А. А. Намитокова (1961) отличается от основного метода тем, что вместо исследования препаратов пленки используют половину содержимого пробирки (каждый раз добавляя новую порцию насыщенного раствора азотнокислого натрия), фильтруют и исследуют фильтры.

Н. А. Романенко (1968) рекомендует исследовать на яйца гельминтов пробы почвы и осадка сточных вод с помощью аппарата, предложенного Г. Ш. Гуджабидзе. 50 г почвы тщательно перемешивают в течение 1 мин. в 150 мл воды в центрифужных пробирках (емкостью 250 мл) специальными лопастями, которые приводятся в действие электромотором. Смесь центрифугируют 3 мин. при 1000 об/мин, воду сливают и, добавив 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия, перемешивают и снова центрифугируют 3 мин. Пробирки с пробами устанавливают в штатив, доливают раствор азотнокислого натрия до образования выпуклого мениска, покрывают предметными стеклами (10 х 6 см) и отстаивают 10-15 мин., затем стекла снимают и исследуют; процедуру повторяют не менее 4 раз.

Исследование на личинки гельминтов по методу Берманна (1917). 200-400 г почвы помещают в кусочке марли на металлическую сетку (с диам, отверстий 1-2 мм), надетую на широкую часть стеклянной воронки, укрепленной в штативе. На узкий конец воронки натянута резиновая трубка с зажимом. Воронку наполняют теплой (t° 50°) водой так, чтобы нижняя часть сетки с почвой соприкасалась с водой. В силу термотропности личинки активно выползают в теплую воду и, оседая, скапливаются в нижней части резиновой трубки над зажимом. Через 3-4 часа из воронки выпускают в пробирку 50 мл содержимого, центрифугируют и исследуют осадок.

Исследование овощей, фруктов и ягод

Исследуют преимущественно овощи, ягоды и фрукты, употребляемые в пищу без термической обработки. Метод 3. Г. Васильковой (1948). По 5-10 штук овощей или фруктов (ок. 0,5 кг) или 100- 200 г зелени (салат, зеленый лук) заливают на несколько часов водой в широкогорлых стеклянных банках с притертыми пробками и встряхивают 10-20 мин. в аппарате для встряхивания или вручную. Воду сливают, исследуемые объекты прополаскивают чистой водой и всю смывную воду фильтруют в аппарате Гольдмана; фильтры исследуют, просветлив глицерином. Можно подкрашивать фильтры 25% раствором Люголя в глицерине; при этом яйца гельминтов окрашиваются в коричневый цвет и их легко распознать среди крахмальных зерен, окрашенных в синий цвет. Большой осадок обрабатывают, как почву.

Исследование смывов с предметов обихода и с рук. Кисточкой для клея (или ватным тампоном, обернутым кусочком капроновой ткани), смоченной в 2% растворе двууглекислой соды, многократно проводят по обследуемому предмету или рукам, после чего ополаскивают в том же растворе, налитом в пробирку. В лаборатории кисточки и тампоны прополаскивают чистой водой; все смывные воды центрифугируют и исследуют осадок.

Метод В. А. Гефтер (1960). Пыль с мягкого инвентаря эффективнее собирать при помощи пылесоса, подключенного к воронке, к-рая состоит из 2 разъемных частей: на поверхность нижней части, покрытой металлической или пластмассовой сеткой, помещают мембранный фильтр и укрепляют его, надев верхнюю часть воронки. Собранную воронку присоединяют к шлангу пылесоса резиновой трубкой. Пыль с предмета собирают в течение 3 мин., после чего фильтр вынимают и заменяют новым. В лаборатории фильтры просматривают под микроскопом, просветлив их глицерином. Если слой пыли на фильтре велик, его соскабливают и просматривают в виде мазков или обрабатывают, как почву.

Иммунологические методы диагностики

Возможность использования иммунол. методов для диагностики гельминтозов обусловлена способностью гельминтов продуцировать активные антигены, воздействующие на иммунокомпетентные клетки хозяина и стимулирующие продукцию антител. Наиболее эффективны иммунодиагностические методы при кишечных гельминтозах, когда секреты и экскреты гельминтов, обладающие антигенной активностью, попадают непосредственно в кровь хозяина. Иммунол, реакции используют для диагностики аскаридоза, трихинеллеза, филяриатозов, шистосоматозов, эхинококкоза и альвеококкоза, цистицеркоза, парагонимоза, симптомокомплекса larva migrans- (токсокароз, ангиостронгилез) и др. Применяют различные серол, тесты (реакции преципитации, агглютинации, связывания комплемента, флюоресцирующих антител) и внутрикожные аллергические пробы. Антигены готовят из личинок и половозрелых гельминтов, используя солевые экстракты гомогенатов свежезамороженных или лиофилизированных тканей, а также разные биологически активные жидкости (жидкость из эхинококковых пузырей, полостную жидкость аскарид и др.). В связи с тем что гельминты обладают весьма сложной антигенной структурой и в их антигенной мозаике имеются компоненты и отдельные детерминанты, перекрестно реагирующие с другими видами гельминтов, бактериями, антигенами хозяина, разрабатываются методы очистки их от неспецифических компонентов. Фракционирование проводят разными методами: гель-фильтрацией в колонках с сефадексами, ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе, обработкой кислотами и др. Фракционные антигены обладают обычно более высокой специфичностью, чем цельные экстракты, активность же их приблизительно одинакова. Иммунодиагностические методы находят все большее применение. Реакции используют не только для наиболее полного и раннего выявления больных, но и для исследования очагов и изучения эпидемиологии гельминтозов.

Серологические реакции. Реакцию микропреципитации на живых личинках применяют для диагностики нематодозов - преимагинальной фазы аскаридоза, анкилостомидозов, трихинеллеза. Реакция становится положительной через 5- 10 дней после заражения (аскаридозом, анкилостомидозами) и сохраняется в течение 90-100 дней. Антигеном служат живые личинки нематод, выделенные из тканей экспериментально зараженных лабораторных животных. Выделенных личинок тщательно отмывают от белков хозяина стерильным физиол, раствором и дистиллированной водой и по 10-15 экз. помещают с помощью пастеровской пипетки на стерильное предметное стекло с луночкой. Наносят 2-3 капли испытуемой сыворотки, накрывают стерильным покровным стеклом, заключают во влажную камеру (чашка Петри, выстланная увлажненной фильтровальной бумагой) и выдерживают 24-48 час. в термостате при t° 37°. При положительной реакции под малым увеличением микроскопа видны вокруг ротового и анального отверстий личинок серовато-белые, слегка опалесцирующие массы преципитатов шаровидной или зигзагообразной формы. Эффективность реакции достигает 85-95% .

Реакция кольцепреципитации разработана В. П. Пашуком (1957) для диагностики трихинеллеза. Реакция становится положительной на 2--3-й неделе болезни. Эффективность ее достигает 80-90% . Антигеном служит экстракт порошка из высушенных при t° 35° личинок, выделенных из мышц зараженных животных. В пробирки диам. 0,5 см наливают по 0,1 мл каждого разведения антигена и осторожно наслаивают на него (или опускают на дно) равное количество испытуемой сыворотки так, чтобы жидкости не смешивались. Пробирки выдерживают 30 мин. в термостате при t° 37°, а затем 30- 60 мин. при комнатной температуре. При положительной реакции на границе соприкосновения антигена и сыворотки появляется беловатое нежное кольцо, легко распадающееся при встряхивании.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлоню (О. Ouchterlony, 1949) в микромодификации А. И. Гусева и В. С. Цветкова предложена И. А. Гиновкер, Е. А. Забозлаевой, А. В. Дорониным (1970) для диагностики ранней фазы описторхоза. По предварительным данным, ее эффективность 87%. Антигеном служит экстракт гомогената свежезамороженных половозрелых описторхисов, выделенных из печени кошек.

Реакция непрямой гемагглютинации (см.) с диагностикумом - взвесью формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных эхинококковой жидкостью,- разработана

Л. Н. Степанковской (1972) для диагностики эхинококкоза и альвеококкоза.

РНГА с диагностикумом из формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных экстрактом гомогената свежезамороженных цистицерков свиного цепня, предложена Л. М. Коноваловой (1973) для диагностики цистицеркоза мозга; она эффективна в 85% случаев.

РНГА с аскаридным диагностикумом предложена для диагностики преимагинальной фазы аскаридоза.

Реакция связывания комплемента (см.) ставится по обычной методике и используется для диагностики трихинеллеза и цистицеркоза.

Метод люминесцирующих антител (непрямой метод). Этот метод с обезжиренным сухим гомогенатом цистицерков свиного цепня в качестве антигена, фиксированным на предметном стекле, разработан JI. М. Коноваловой (1973) для диагностики цистицеркоза человека. Та же реакция с гистол, срезами личинок трихинелл в качестве антигена разработана для диагностики трихинеллеза.

E. С. Лейкина, В. А. Гефтер.

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Предметные стекла.
2. Покровные стекла.
3. Стеклянные палочки длиной 15-20 см с оплавленными концами.
4. Чашки Петри.
5. Йодистый калий.
6. Нейтральрот.
7. Бриллиантгрюн.
8. Судан III.
9. Этиловый спирт 96°.
10. Дистиллированная вода.
11. Дезинфицирующие растворы.

Приготовление нативных препаратов для микроскопического исследования

Препараты для микроскопии готовят из растертого с водой кала и из видимых примесей (если они имеются) . Стеклянную палочку с оплавленным концом вносят в растертый кал. Взятую каплю материала помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и слегка придавливают его сверху.

Из видимых примесей готовят второй препарат с помощью шпателя и иглы. Слизь, кровь, остатки пищи и другие образования помещают на предметное стекло рядом с первым препаратом, приготовленным из растертого кала, и накрывают покровным стеклом (слизистые клочки предварительно промывают водопроводной водой).

Для лучшего распознавания и выявления микроскопических элементов кала окрашивают три препарата: первый — реактивом Люголя, второй — смесью нейтральрот + бриллиантгрюн, третий — Суданом III.

Реактивы для окраски препаратов готовят следующим образом:

1. Реактив Люголя: к 2 г йодистого калия, помещенного в колбочку емкостью 50 мл, приливают около 1 мл дистиллированной воды, прибавляют 1 г кристаллического йода и дистиллированной воды до метки 50 мл.
2. Раствор краски судан III: растворяют 2 г краски судан III в 10 мл 96° спирта и приливают 90 мл 80° спирта или ледяной уксусной кислоты до получения ярко-красного окрашивания.
3. 1% водный раствор нейтральрота: в колбочку на 100 мл помещают 1 г краски нейтральрот и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.
4. 2% водный раствор бриллиантгрюна: 2 г краски бриллиантгрюн помещают в колбочку на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.

Техника окраски препаратов . К препарату прибавляют 1-2 капли соответствующего реактива, затем вновь накрывают его покровным стеклом и изучают под микроскопом. Техника изучения препаратов кала под микроскопом такая же, как и .

Микроскопическое изучение элементов кала

Элементы, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании препаратов кала, подразделяют на три группы: а) элементы пищи (животного и растительного происхождения), б) элементы кишечной стенки и в) кристаллические образования.

К первой группе относятся:
а) Мышечные волокна (рис. 19). Имеют (в нормальном кале) вид неправильных четырехугольников или округлых образований желтой окраски (цвет охры), в центре окрашены более интенсивно, чем по краям, при окраске раствором Люголя принимают цвет красного дерева. Непереваренные или недостаточно переваренные мышечные волокна имеют ясно выраженные углы, а также поперечную и продольную исчерченность, подобпые волокна можно видеть изолированно и в виде групп, соединенных между собой.

б) Соединительная ткань (рис. 20). Имеет вид перекрещивающихся тонких волоконец, встречающихся изолированно или в сочетании с группами мышечных волокон.

Рис. 20. Соединительная ткань в виде густых скоплений эластических волокон.

в) Жир нейтральный (рис. 21, 1) имеет вид бесцветных или слегка желтоватых капель разной величины или крупных лужиц. Будучи окрашены Суданом III, становятся красными, оранжевыми или желтыми.

Рис. 21. Жиры (1), жирные кислоты (2), мыла (3, 4) в испражнениях.

г) Жирные кислоты (рис. 21, 2). Представляют собой кристаллы, имеющие вид иголок, лежащих поодиночке или собранных в пучки. При окраске Суданом III не окрашиваются (капли и глыбки окрашиваются так же, как и жиры), смесью 1% раствора нейтральрота и 2% раствора бриллиантгрюна окрашиваются в красный цвет.

д) Мыла (рис. 21, 3-4) — кальциевые и магниевые соли жирных кислот. Встречаются в виде глыбок или игольчатых кристаллов, более коротких, чем жирные кислоты, и чаще сгруппированных в пучки. Мыла Суданом III не окрашиваются, а смесыо 1% раствора нейтральрота и 2% раствора бриллиантгрюна окрашиваются в зеленый цвет.

е) Крахмал (рис. 22, 3). Крахмальные зерна округлой или овальной формы, лежат изолированно, каждое зерно сильно преломляет свет. В зависимости от степени переваривания зерен концентрическая исчерченность может быть выражена по-разному. Встречают крахмальные зерна и внутри крахмалистой клетки (картофель, бобы). Раствором Люголя неизмененные крахмалыные зерна окрашиваются в синий цвет, а измененные — в лилово-красноватый.

ж) Дрожжевые грибки . Это образования овальной формы, снабженные почковидными отростками. Раствором Люголя окрашиваются в желтовато-красный цвет.

з) Растительная клетчатка (рис. 22). Перевариваемая клетчатка — крупные прозрачные, как правило, неокрашенные образования неправильной формы, имеющие ячеистое строение (картофель, фасоль, каштан и др.). Неперевариваемая клетчатка (оболочка хлебных зерен, растительные сосуды, волоски, пласты эпидермы и пр.) имеет широкие, утолщенные межклеточные пространства, двуконтурные клетки, непрозрачна, окрашена в коричневый или желтый цвет.

Вторую группу составляют:
а) Слизь — прозрачная гомогенная масса. Как правило, встречается с лейкоцитами, эритроцитами и эпителием. Слизь из верхних отделов кишечника смешана с каловыми массами.

б) Лейкоциты . Могут быть неизмененными, но чаще подвергаются распаду и изменяются. Лучше различать их в окрашенных (раствором Люголя, Суданом III и пр.) препаратах. Эозинофилы содержат однородную, сильно преломляющую свет зернистость. Среди эозинофилов иногда обнаруживают кристаллы Шарко-Лейдена.

в) Эритроциты . Могут быть неизмененными и выщелоченными. Кровь может выделяться с калом и в виде аморфного распада, окрашенного в буроватый цвет.

г) Эпителий . Клетки различной формы и величины: 1) плоский эпителий (выстилающий заднепроходное отверстие) — полигональной формы, с маленьким ядром; 2) эпителий, выстилающий слизистую оболочку кишечника, — цилиндрической формы с четко контурированным ядром. Иногда они могут быть измененной формы и различной величины с жировым перерождением и вакуолизацией. При злокачественном перерождении имеют вид полиморфных клеток с большим пузырьковидным ядром и с грубозернистой, вакуолизированной протоплазмой, располагающихся отдельно и группами.

В третью группу входят кристаллические образования:
а) Кристаллы трипельфосфата .
б) Кристаллы оксалатов .
в) Билирубин .
г) Гематоидин .

Подробное описание указанных элементов дано в теме « ».

д) Кристаллы закиси висмута (рис. 23, 2) — темно-бурые, прямоугольные или ромбические образования. Обнаруживаются после приема солей висмута.

е) Соли бария (рис. 23, 1) — однородные мелкие бесцветные глыбки. Встречаются в течение нескольких дней после проведения рентгенологического исследования желудка.

ж) Частицы угля (рис. 23, 3). Окрашены в черный цвет, по форме напоминают кристаллы висмута.

Pиc. 23. Соли бария (1), висмута (2), уголь (3).