Главная Головокружение Что такое неслучайная инактивация х хромосомы. Генетическая инактивация х-хромосомы. Что включает в себя исследование неслучайной инактивации Х-хромосомы

Что такое неслучайная инактивация х хромосомы. Генетическая инактивация х-хромосомы. Что включает в себя исследование неслучайной инактивации Х-хромосомы

Инактивация X-хромосомы, ИXХ (англ. XIC, X-chromosome inactivation) — процесс дозовой компенсации генов у млекопитающих, который приводит к транскрипционной активности только одной половой X-хромосомы у самок и самцов. Инактивация происходит по правилу (n-1), где n — количество X-хромосом в ядре. X-хромосома — одна из двух половых хромосом у млекопитающих. У большинства млекопитающих самцы имеют половую Y-хромосому и одну X-хромосому, тогда как у самок — две X-хромосомы.

Классическое определение инактивации X-хромосомы — процесс, в котором одна из двух половых хромосом у самок млекопитающих становится неактивной.

Однако при определенных патологиях и анеуплоидии количество X-хромосом может быть другой: так при синдроме Клайнфельтера возможные варианты существ мужского пола XXY, XXXY, XXXXY; при синдроме Шерешевского-Тернера самки есть моносомиком по X-хромосоме — X0, также существуют самки-трисомик по X — XXX. Инактивация X-хромосомы происходит таким образом, что активной остается только одна X-хромосома, а все остальные превращаются в тельца Бара. (Например, в нормальной самки XX активной будет одна X-хромосома, вторая инактивируется, у самца с синдромом Клайнфельтера XXXY будет активной одна X-хромосома, две — нет).

История открытия

Открытию инактивации X-хромосомы Мэри Лайон в 1961 году предшествовала серия открытий в цитогенетике.

Работы Теодора Бовери (англ. Theodor Heinrich Boveri) 1888 привели сильные доводы в поддержку гипотезы, что именно хромосомы являются носителями генетической информации в клетке. Уже 1905 Натти Стивенс (англ. Nettie Maria Stevens) предложила теорию, половые хромосомы отличаются у разных полов. Эдмунд Уилсон (англ. Edmund Beecher Wilson) сделал аналогичное открытие независимо 1905 года. 1949 году работы Мюррея Барра (англ. Murray Llewellyn Barr) доказали, что пол дифференцированных соматических клеток модельных объектов может быть определено путем подсчета структур в ядре, которым дали название тельца Барра.

1959 Сусуму Оно (англ. Susumu Ohno) установил, что тельца Барра — то есть X-хромосома. 1959 В. Вельшонс (англ. WJ Welshons) и лианы Расселл (англ. Liane B. Russell) доказали, что мыши-моносомиком по X-хромосоме, X0, — фенотипически нормальные, способные к размножению самки, навело на мысль, что только одной X-хромосомы достаточно для нормального развития.

Мере Лайон (англ. Mary F. Lyon) 1961 изучала окраски меха мышей, что является признаком, сцепленной с полом, и кодируется в X-хромосоме. Она установила, что самцы XY всегда окрашены монотонно, тогда как самки XX могут быть фенотипическими мозаиками — иметь разноокрашенных мех, а самцы XXY также могут иметь различную окраску меха. Таким образом Мэри Лайон установила, что неактивная X-хромосома (у тельцах Барра), может быть как родительской, так и материнского происхождения.

По случаю 50 лет открытия инактивации X-хромосомы в июле 2011 года была проведена конференция Европейской Организации Молекулярной Биологии.

Механизм инактивации

У большинства млекопитающих, самки имеют две Х-хромосомы, в то время как самцы имеют одну Х-хромосому и одну Y-хромосому. Y-хромосома определяет пол в раннем эмбриональном периоде путем экспрессии транскрипционного фактора, кодируется SRY геном, который включает каскад реакций, приводящих к фенотипу самца. При отсутствии SRY развивается фенотип самки. У самцов (XY) и самок (XX) возникает неравновесие в дозе генов, особенно учитывая, что Y-хромосома намного меньше Х-хромосому, и кодирует лишь небольшое количество генов. Инактивация X-хромосомы балансирует такую неравновесие.

Одна из Х-хромосом в клетках самок выключается эпигенетически, то есть последовательность нуклеотидов в ДНК не меняется. Вместо этого образуется плотный гетерохроматин — физико-химическое состояние всей хромосомы или ее части, в котором затруднена взаимодействие факторов транскрипции с ДНК — и процесс считывания РНК с этой хромосомы не происходит. Образование гетерохроматина происходит с помощью метилирования ДНК и модификации гистонов белков, а при инактивации Х-хромосомы важную роль играют длинные некодирующие РНК.

Процесс инактивации X-хромосомы состоит из нескольких этапов:

подсчет X-хромосом;
выбор хромосомы для инактивации;
начало инактивации;
поддержания X-хромосомы в неактивном состоянии.

В дальнейшем неактивная X-хромосома остается стабильно заглушенной. В этом важную роль играет метилирования ДНК — эпигенетический процесс, заключающийся в добавлении метильной группы к нуклеотида цитозина. Такая биохимическая изменение может поддерживаться долгое время и влиять на активность генов.

Компоненты гетерохроматина неактивной X-хромосомы отличаются от гетерохроматина в других хромосомах. На неактивной X-хромосоме найден вариант гистонов белка macroH2A, и белок Trithorax. Также установлено, что, в отличие от других хромосом, белковые компоненты неактивной X-хромосомы распределены равномерно по всей ее длине.

Изучение инактивации X-хромосомы пролило свет на несколько молекулярно-биологических процессов: роль длинных некодирующих РНК, геномный импринтинг и соматическое спаривания хромосом у млекопитающих.

Методика RAP-MS (англ. RNA antisense purification followed by quantitative mass spectrometry) позволяет изучать in vivo взаимодействие белков и длинных некодирующих РНК. С помощью RAP-MS в 2015 году установили, что для размещения днРНК Xist на хромосоме, необходимо действие белка SAFA (англ. Scaffold attachment factor A). Кроме этого, исключение (нокдаун) генов, кодирующих белки, SHARP (англ. SMRT and HDAC1-associated repressor protein) и LBR (англ. Lamin-B receptor) приводило к остановке инактивации X-хромосомы в опытах над эмбриональными стволовыми клетками мышей.

При размещении Xist на X-хромосоме с этой хромосомой уже не соединяется РНК-полимераза II — полимераза, которая транскрибирует большинство мРНК. Исключение гена, кодирующего SAFA приводило к хаотическому размещения Xist, тогда как исключение гена, кодирующего белок SHARP приводило к возвращению РНК-полимеразы II. Также белок SHARP взаимодействует с белками-ремодуляторамы структуры хроматина, такими как гистондеацетилазы. Причем, исключение гистондеацетилазы 3 (HDAC3), а не других видов гистондеацетилаз, приводило к нарушению механизма инактивации X-хромосомы.

Важным элементом инактивации является действие репрессивного комплекса Polycomb, PRC2 (англ. Polycomb repressive complex 2), однако действие комплекса PRC2 не важна при инициации процесса инактивации, скорее в поддержании хромосомы в инактивированном состоянии — триметилюванни 27 лизина H3 гистона (H3K27me3 см табличку "Сравнение еу- и гетерохроматина ")

ЦИX — центр инактивации X-хромосомы

Исследования на мышиных моделях установили, что для инактивации X-хромосомы нужна особая участок — центр инактивации X-хромосомы, ЦИX (англ. XIC, X inactivation centre). Центр инактивации X-хромосомы состоит примерно из миллиона пар оснований, имеет несколько элементов, участвующих в инактивации X-хромосомы, и содержит по крайней мере четыре гена. Для начала инактивации нужно два таких центра, по одному на каждой хромосоме, и необходимо, чтобы между ними была связь. Взаимодействие между двумя гомологичными X-хромосомами происходит в центре инактивации. Но остается открытым вопрос, что именно является причиной, а что следствием: или сближение хромосом приводит к началу инактивации, или наоборот.

Xist

В пределах участка центра инактивации X-хромосомы закодировано ген Xist (англ. X-inactive specific transcript), который транскриптуеться в длинную некодирующих РНК Xist. Xist покрывает ту X-хромосому, что будет неактивной (сначала в зоне ЦИX, а затем — по всей длине хромосомы). В процессе эмбрионального развития Xist экспрессируется с обеих хромосом, но потом в одной X-хромосоме экспрессия Xist прекращается (и именно эта хромосома останется активной). Подавление экспрессии Xist совпадает по времени с началом инактивации X-хромосомы.

При гетерозиготной мутации Xist, то есть такой, когда нормальный Xist есть только на одной из двух гомологичных хромосом, и X-хромосома, в которой есть мутантный Xist, а не инактивируется.

Tsix

С локуса центра инактивации X-хромосомы считывается антизмистовний транскрипт с комплементарной цепи ДНК того же гена Xist. Такой нкРНК дали название Tsix (Xist написан задом-наперед), и установили, что Tsix — отрицательный регулятор Xist, и его экспрессия необходима для поддержки X-хромосомы в активном состоянии. Много трудов указывают на то, что именно соотношение Tsix / Xist важно для выбора, который аллель будет глушиться, и, соответственно, какую хромосому будет инактивированная. Есть данные, что именно Tsix приводит к ассоциации двух гомологичных X-хромосом, и экспрессия Tsix РНК является необходимым, но не достаточным условием для подсчета и выбора хромосомы для инактивации

Tsix стала первой известной антизмистовною РНК млекопитающих, встречается в природе и имеет четкую функцию in vivo.

Дополнительные регуляторы

В зоне центра инактивации X-хромосомы найдено большое количество участков, которые влияют на процесс ИXХ. Такие участки влияют на процесс инактивации X-хромосомы как в цис, так и в транс-положении, то есть как на одной и той же хромосоме, на которой они расположены (цис-регуляторный элемент), так и на другой (транс-регуляторный элемент). Многие некодирующих РНК влияют на активность Xist и Tsix (Jpx, Ftx и Tsx).

Xite

Xite (англ. X-inactivation intergenic transcription element) — еще один некодирующих транскрипт, который расположен перед Tsix и действует как усилитель экспрессии Tsix на будущий активной X-хромосоме.

LINE1

В геноме человека значительную часть всей последовательности ДНК составляют так называемые транспозонов, или мобильные элементы генома. Часть их является Ретротранспозон (у человека Ретротранспозон занимают до 42% генома) — мобильными элементами, которые копируют и вставляют себя в геном с помощью транскрипции с ДНК на РНК, а затем обратной транскрипции с РНК в ДНК. LINE1 (англ. Long Interspersed Nuclear Elements) — один из активных ретротранспозонов у человека. LINE1 встречается в X-хромосоме гораздо чаще, чем в других хромосомах. Есть работы, которые указывают на участие РНК LINE1 в инактивации X-хромосомы.

Серия активаций и инактиваций X-хромосом

На начальных стадиях развития разница, какого происхождения X-хромосома, родительского или материнского. С начала эмбриогенеза X-хромосома отцовского происхождения всегда неактивна. В этом процессе важную роль играет геномный импринтинг. Затем, в период формирования бластулы обе X-хромосомы активируются. В дальнейшем развитии в эмбриональных клетках инактивация X-хромосом происходит в произвольном порядке, независимо от происхождения X-хромосом. Но в позаембриональних тканях (включая трофобластом, что формирует большую часть плаценты) активной остается только X-хромосома от матери, а родительская X-хромосома инактивируется.

Далее в зародыше при формировании будущих половых клеток (гаметогенез) происходит следующий этап активаций X-хромосом перед мейотического деления. Каждая из X-хромосом получает постоянную импринтну метку, указывающую, которого она происхождения.

Гены, считываются с неактивной X-хромосомы

Некоторые гены, расположенные на неактивной X-хромосоме, избегают подавления и экспрессируются с обеих X-хромосом. В человеческой линии фибробластов 15% генов, расположенных на неактивной X-хромосоме, в той или иной степени экспрессируются. Уровень считывания этих генов сильно зависит от того, в какой части хромосомы они закодированы. Такие гены приводят к многообразию, которое зависит от пола и типа ткани.

Инактивация X-хромосомы у разных видов

Основные работы по изучению инактивации X-хромосомы было сделано на мышах. В последние годы поступает все больше данных, мышиная модель инактивации X-хромосомы отличается от других млекопитающих.

У кроликов и людей Xist -гомолог не подлежит импринтинга, Xist считывается с обеих хромосом. У кроликов это может включить процесс ИXХ на обоих X-хромосомах.

Более того, X-хромосомы у многих видов имеют достаточно специфический набор генов: такие гены имеют низкий уровень экспрессии в соматических тканях, но высокий уровень экспрессии — в тканях, участвующих в репродуктивных функциях организма (например, яичники).

XACT РНК у человека

2013 исследователи РНК человека обнаружили длинную некодирующих РНК XACT (англ. X-active coating transcript), что связывается с активной X-хромосомой. XACT экспрессируется с активной X-хромосомы, но при дифференциации глушится, и уже в дифференцированных клетках (таких, как фибробласты) XACT РНК нет. При отсутствии XIST -РНК, XACT экспрессируется с обеих X-хромосом у человека, но не в мыши.

Сумчатые

У сумчатых форуме Xist -РНК и неизвестно, как происходит процесс инактивации X-хромосомы. Но у одного из видов опоссумов, Monodelphis domestica, найдено длинную некодирующих РНК Rsx (англ. RNA-on-the-silent X), которая похожа по функциям с Xist и участвует в инактивации X-хромосомы.

Случайность выбора X-хромосомы

Ранее считалось, что выбор хромосомы для инактивации полностью случайный, и каждая из двух гомологичных X-хромосом будет инактивированная с вероятностью 50%. Но появились публикации, доказывающие, что в некоторых модельных организмах генетические факторы влияют на выбор. Так, у мышей существуют регуляторные элементы (англ. Xce, X-controlling element), которые имеют три аллельные формы, и одна из них, Xce c, чаще встречается в активной X-хромосоме, тогда как Xce a чаще встречается в неактивной.

Остается невыясненным, в произвольном порядке происходит инактивация X-хромосомы человека. Последние исследования указывают на то, что генетическое окружение может влиять на выбор X-хромосомы, которая будет инактивированная.

Неравновесная инактивация Х-хромосомы может свидетельствовать о наличии минимальных генетических перестроек, что оказывает негативное влияние на функцию яичников. Исследование неравновесной инактивации Х-хромосомы является эффективным методом генетического диагностирования, который позволяет провести анализ состояния активных хромосом в женском организме.

Аномалии в ДНК матери – прямая угроза рождению здорового ребёнка, способного в течение жизни развиваться умственно и физически. Пройдите обследование в МЖЦ, чтобы получить семейный анамнез, выяснить причины бесплодия, правильно подготовиться к ЭКО. У нас вы можете проконсультироваться по вопросам возможностей лечения генетических отклонений.

Срок изготовления:

Биоматериал:

Кровь из вены

Синонимы:

X-inactivation

График приема:

С 8:00 до 12:00 с понедельника по субботу

Пациенты:

С 18 лет (взрослые)

Стоимость анализа на онтогенетическую аномалию*

4 800 Р Исследование неравновесной (неслучайной) инактивации Х-хромосомы

Особенности проведения исследования

Каждая клетка организма женщины содержит набор из двух Х-хромосом, одна из которых активна, вторая – нет. Подобное клеточное состояние позволяет минимизировать риск развития генных мутаций, которые в тяжелой форму могут привести к гибели. Подобный феномен, наблюдающийся в половых хромосомах, происходит в процессе внутриутробного развития плода.

Одна из половых хромосом спонтанно утрачивает свою функцию и структуру, что называется процессом случайной инактивации. При небольших мутациях – делеции, происходит запуск механизма, который приводит к утрате функций половой Х-хромосомы и сбою детородной программы женского организма.

Показания:

наличие стойкого женского бесплодия, независимо от возраста;
склерополикистоз яичников;
некоррегируемые перепады гормональной активности яичников;
преждевременное увядание и/или истощение яичников.

Интерпретация полученных результатов

Неслучайная инактивация Х-хромосомы может оцениваться исключительно опытным специалистом в данной сфере. В результатах анализа указывается наличие или отсутствие неравновесной инактивации Х-хромосомы. При ее обнаружении возможны генетические проблемы в диагностировании женского бесплодия .

Женщины должны знать, что исследование неравновесной инактивации Х-хромосомы позволяет выявить состояние половой хромосомы. При выявлении структурных изменений речь идет о частичной утрате их функции, что негативно сказывается на детородной функции женского организма. Проведение анализа позволит более точно диагностировать истинную причину бесплодия и скорректировать схему лечения.

Стоимость исследования неравновесной (неслучайной) инактивации Х-хромосомы – 4 800 рублей.

Исследование неслучайной инактивации Х-хромосомы - это метод генетической диагностики, при помощи которого исследуют состояние активной (функционирующей) Х-хромосомы клеток женского организма.

Сроки выполнения	до 15 дней

Синонимы (rus)	Анализ неравновесной инактивации Х-хромосомы, определение неслучайной инактивацииглавной Х-хромосомы

Cинонимы (eng)	X-inactivation

Методы	Цитогенетическое тестирование при помощи спектрального кариотипирования

Единицы измерения	Результат представлен в виде специальной записи, отражающей структуру хромосомного набора. В заключении непосредственно указывается обнаружена, или не обнаружена инактивация Х-хромосомы.

Подготовка к исследованию	Забор биологического материала и подготовка к его сдаче производится по общим правилам. Лучше сдавать анализ в первой половине дня, исключить употребление пищи и курение не менее, чем за 2 часа. За неделю до забора крови должны быть исключены вредные воздействия на организм, в том числе медикаментозные.

Тип биоматериала и способы его взятия	Кровь из вены исследуемой женщины

Что включает в себя исследование неслучайной инактивации Х-хромосомыКаждая из клеток женского организма в своем хромосомном наборе содержит две Х-хромосомы . Одна из них пребывает в активном состоянии, а вторая неактивна. Благодаря этому ликвидируется избыток генетического материала, который мог бы стать причиной разных генных мутаций и гибели женского организма. Такой феномен естественной дезактивации одной из половых хромосом происходит еще внутриутробно. Как только формируется хромосомный набор эмбриона и в нем оказывается две полноценные Х-хромосомы, что определяет женский пол, одна из половых хромосом спонтанно становится неактивной, утрачивая свою структуру и функции. Этот закономерный процесс называется случайной инактивацией Х-хромосомы.

На протяжении жизни женщины, размножающиеся клетки передают активированную и инактивированную хромосому дочерним клеткам. Если активная хромосома сохраняет свою структуру, женский организм идеально функционирует. Но в тех случаях, когда эта Х-хромосома становится жертвой небольших мутаций (как правило, это делеции - отрыв фрагментов), включается специальный ген XIST . Он запускает неслучайную инактивацию измененной активной хромосомы. При этом она утрачивает часть своих функций. В первую очередь, страдает возможность полноценно кодировать информацию в отношении детородных функций женского организма.

Важно помнить! Анализ неравновесной инактивации Х-хромосомы - это не что иное, как определение состояния единственной функционирующей женской половой хромосомы. Обнаружение ее структурных изменений является свидетельством частичной утраты функций, что не может не сказаться на функциональных возможностях женского организма!

Для чего проводится анализ неравновесной инактивацииИсследуя структуру Х-хромосом женщины на предмет обнаружения неравновесной инактивации, можно сделать вывод о причинах женского бесплодия или нарушений менструально-овуляторной деятельности. Целесообразность приводить подобное исследование возникает при:

Стойком бесплодии у женщин всех возрастных групп;
Склерополикистозе яичников ;
Преждевременном истощении и увядании яичников;
Некорригируемых перепадах гормональной активности яичников , сочетающихся любыми нарушениями их структуры.

Как правильно оценить результатыОценкой результатов анализа должен заниматься исключительно знающий специалист. В заключении указывается обнаружена или не обнаружена неслучайная Х-хромосомная инактивация. Если она имеет место, это говорит, что проблема бесплодия или другие нарушения женской половой сферы вызваны поломками на генном уровне.
Срок проведения анализа: Стоимость проведения анализа: руб.Добавить в калькулятор

Вопросы и ответы

Стоимость анализов Вопрос: Здравствуйте! Просьба, написать стоимость следующих анализов. Планирую сдавать в г.Сочи Старонасыпная ул., 22, микрорайон Адлер, БЦ Офис Плаза, эт. 2 Для женщины: 1.УЗИ органов малого таза на 5-8 день менструального цикла. 2.Определение группы крови(в том числе и резус фактора). 3.Клинический анализ крови, включая свертываемость крови 4.Биохимический анализ крови (в т.ч. глюкоза, общий белок, прямой и непрямой билирубин, мочевина) 5.Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С 6.Коагулограмма (по показаниям) 7.Общий анализ мочи 8.Исследование состояния матки и маточных труб (лапароскопия, гистеросальпингография или гистеросальпингоскопия) - по показаниям. 9.Инфекционное обследование: - бактериологическое исследование отделяемого влагалища, цервикального канала из уретры (мазок на флору) - микроскопическое исследование отделяемого цервикального канала на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, трихомонады, грибы рода Candida (посев из цервикального канала) - ПЦР (хламидии, уреа- и микоплазмы, вирус простого герпеса I-II типов, цитомегаловирус) (цервикальный канал) - определение антител класса М, G на токсоплазму, краснуху (кровь) 10.ЭКГ 11.Флюорография легких (действительна 12 месяцев). 12.Консультация терапевта 13.Кольпоскопия и цитологическое исследование шейки матки. 14.Маммография (женщинам старше 35 лет), УЗИ молочных желез (женщинам до 35 лет). 15.Хромосомный анализ супружеским парам старше 35 лет, женщинам, имеющим в анамнезе случаи врожденных пороков развития и хромосомных болезней, в том числе и у близких родственников; женщинам, страдающим первичной аменореей. 16.Гистероскопия и биопсия эндометрия (по показаниям). 17.Гормональное обследование: кровь на 2-5 дни менструального цикла: ЛГ, ФСГ, пролактин, тестостерон (св., общ.), эстрадиол, прогестерон, кортизол (800-1700), Т3 св, Т4 св, ТТГ, СТГ, АМГ, 17-ОП, ДГА-S . кровь на 20-22 день цикла: прогестерон. 18. Консультация эндокринолога(по показаниям). 19. Заключение профильных специалистов при наличии экстрагенитальной патологии (по показаниям). 20.УЗИ щитовидной железы и паращитовидных желез, почек и надпочечников (по показаниям). Для мужчины: 1.Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С (анализы действительны 3 месяца). 2. Спермограмма и МАР-тест 3. Микроскопическое исследование эякулята на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, трихомонады, грибы рода Candida (посев эякулята) (анализы действительны 6 месяцев). 4.ПЦР (хламидии, уреа- и микоплазмы, вирус простого герпеса I-II типов, цитомегаловирус) (эякулят). 5.Консультация андролога/уролога.

Ответ:

Здравствуйте! Стоимость услуг:

Для женщины:

1.УЗИ органов малого таза на 5-8 день менструального цикла. - 1500 руб.

2.Определение группы крови(в том числе и резус фактора). - 490 руб.

3.Клинический анализ крови, - 460 руб. включая свертываемость крови (Исследование времени кровотечения (время кровотечения/свертывания))- 220 руб.

4.Биохимический анализ крови (в т.ч. глюкоза - 159 руб., общий белок - 159 руб., прямой - 159 руб. и непрямой билирубин - 159 руб., мочевина - 159 руб.)

5.Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С - 1560 руб.

6.Коагулограмма (по показаниям)- 820 руб.

7.Общий анализ мочи - 275 руб.

Barr и соавторы (1950), Klinger (1957) и др. предполагали, что половой хроматин образуется гетерохроматическими районами двух половых хромосом (XX). Доказательством этого они считали тот факт, что половой хроматин встречается в клетках самок млекопитающих, имеющих две Х-хромосомы, чего не наблюдается в клетках самцов, где присутствует только одна Х-хромосома. Незначительный процент клеток, содержащих половой хроматин, и его малая величина у самцов ставились в связь с тем, что из-за малых размеров Х-хромосомы в клетках мужских организмов не хватает материала для формирования телец Барра. Однако эта гипотеза в дальнейшем не подтвердилась. Против нее свидетельствовал, в частности, тот факт, что половой хроматин не обнаруживался в полиплоидных клетках самцов, где число Х-хромосом было достаточно для его формирования (Klinger, Schwarzacher, 1960)*.

Позднее было доказано, что половой хроматин образуется за счет одной Х-хромосомы. Ohno и соавторы (1959) исследовали цикл клеток крысы, установив, что только одна Х-хромосома клеток самки находится в гетеропикнотическом состоянии и в интерфазном ядре образует основную массу полового хроматина. То же самое было обнаружено и в клетках рака молочной железы мышей разных линий (Ohno, Hauschka, 1960) (рис. 2).

Рис. 2. Метафазные пластинки нормальной женской клетки до и после ауторадиографии. Стрелка указывает на поздноредуплицирующуюся Х-хромосому (по Kikuchi, Sandberg, 1965).

В дальнейшем Ohno и Makino (1961), используя радиоактивную метку (Н3-тимидин) и авторадиографию в культуре ткани костного мозга индивидов с различным числом Х-хромосом в соматических клетках, обнаружили, что только одна Х-хромосома редуплицируется одновременно с аутосомами, подвергаясь спирализации и инактивации, а вторая Х-хромосома отстает в своем цикле. Исследования Taylor (1960), Morishima и соавторов (1962), German (1964) и др. подтвердили существование поздно редуплицирующейся Х-хромосомы, находящейся в гетеропикнотическом состоянии, обычно располагающейся по периферии интерфазного ядра и цитологически обнаруживающейся в виде телец Барра.

Было установлено, что по количеству глыбок полового хроматина можно судить о числе Х-хромосом. Согласно правилу Stewart (1960), количество глыбок полового хроматина в каждом диплоидном наборе равно n-1 (n - число Х-хромосом). Так, например, в тетра-плоидных клетках и интерфазных ядрах содержатся два тельца полового хроматина. Женщины Х0-негативны по половому хроматину, а клетки женщин - XX и мужчин - XXY несут лишь по одному тельцу полового хроматина (А. А. Прокофьева-Бельговская, 1963; Barr, 1959).

Учение об инактивации одной из Х-хромосом в соматических клетках женского организма было сформулировано почти одновременно несколькими исследователями, работавшими независимо друг от друга. Например, Beutler и соавторы (1962) показали, что ферменты, контролируемые генами, локализованными в Х-хромосоме, обнаруживаются примерно в одинаковом количестве как у женщин, так и у мужчин, хотя, казалось бы, у женщин таких ферментов при наличии двух Х-хромосом должно быть в 2 раза больше. Отсюда следовало, что из двух Х-хромосом клеток женского организма функционирует только одна, а вторая - инактивирована и образует глыбку полового хроматина. Было также доказано, что у женщин-гетерозигот по дефициту энзима Г6ФД имеются две популяции эритроцитов: одна - с нормальным и вторая с мутантным геном (Beutler et al., 1962; Gartler et al„ 1962a, b).

Примерно в то же время были опубликованы еще две сходные гипотезы -«инактивированной Х-хромосомы» (Lyon, 1961, 1962) и «фиксированной дифференциации Х-хромосомы» (Grumbach et al., 1960, 1962). Однако Lyon первой более четко сформулировала основные закономерности поведения Х-хромосом в клетках млекопитающих.

Переход одной из Х-хромосом в гетеропикнотическое состояние означает ее инактивацию, преследующую цель «компенсации дозы»: в клетках женского и мужского организма остается по одной активно функционирующей Х-хромосоме. Считается, что Y-хромосома содержит в основном локусы, определяющие развитие организма в сторону мужского пола (Galton, 1966).

Основные положения гипотезы Lyon сводятся к тому, что у млекопитающих в клетках развивающегося эмбриона женского пола, находящегося на ранних стадиях формирования, происходит переход в гетеропикнотическое состояние (инактивация) одной из Х-хромосом. В одних клетках инактивации подвергается отцовская, в других - материнская (по происхождению) Х-хромосома.

A. A. Prokofjeva-Belgovskaya (1966), а также Grumbach и соавторы (1962) указывают, что у насекомых (дрозофила) в противоположность тому, что наблюдается у млекопитающих, инактивации подвергается только отцовская Х-хромосома, сохраняющая в клетках взрослых особей свое гетеропикнотическое состояние. Последнее характерно для хромосомы на всех стадиях сперматогенеза.

В каждой клетке эмбриона женского пола у млекопитающих выбор того, какая Х-хромосома будет инактивирована- отцовская или материнская,- происходит случайно **. Поэтому представляется справедливым замечание, которое сделал Griineberg (1967): так как предполагается, что инактивация происходит па ранних стадиях развития, когда клетки данной структуры весьма немногочисленны, то случайный подбор «образцов инактивации» может вести к неравномерному распределению клеток с нормальным и мутантным фенотипом (у взрослых особей); допустимо даже, что все клетки могут быть одного «сорта».

Таким образом, возникает мозаичность соматических клеток женского организма: в одних клетках половой хроматин образован гетеропикнотической Х-хромосомой отцовского, в других - материнского происхождения. При наличии гетерозиготности эта мозаичность может служить объектом генетического анализа.

Lyon приводит некоторые доказательства справедливости своей гипотезы. Например, мыши с генотипом Х0 имеют нормальный фенотип; это указывает на то, что одна Х-хромосома оказывается достаточной для нормального развития организма. Мыши, гетерозиготные по локусу, сцепленному с полом, имеют мозаичный фенотип; все сцепленные с полом мутанты по окраске шерсти отличаются этой особенностью. Такая же мозаичность развивается и в случае транслокации аутосомного сегмента на гетеропикнотическую Х-хромосому (см. главу VI).

В опытах на самках мышей, гетерозиготных по двум неаллельным генам, Lyon (1963) показала, что в том случае, когда гены-мутанты расположены на разных Х-хромосомах, одновременной фенотипической экспрессии обоих мутантов в одних и тех же участках тела (например, при изучении окраски шерсти) не наблюдалось. Эти опыты подтверждали справедливость учения о неактивной Х-хромосоме.

De Mars (1967) предполагает, что в Х-хромосоме имеются специальные гены, выделяющие вещества, индуцирующие спирализацию Х-хромосомы. Этот эффект De Mars считает элементарным процессом репрессии, охватывающим целиком всю гетеропикнотическую Х-хромосому и препятствующим ее репликации и считыванию генетической информации. При этом видимая в световом микроскопе конденсация хроматина является частым, но не обязательным условием репрессии неактивной Х-хромосомы.

В соответствии с гипотезой Лайон способность Х-хромосомы к переходу в гетеропикнотическое состояние наследуется в клеточных поколениях. Comings (1966) приводит литературные данные, подтверждающие это положение: клоны фибробластов, взятых у одной негритянки, гетерозиготной по электрофоретическим А- и В-вариантам сцепленного с Х-хромосомой энзима Г6ФД, синтезировали только А- или только В-линию, но не обе вместе. Comings, используя депрессоры Х-хромосомы (полиэтиленсульфонат и другие полианионы), на культуре фибробластов показал, что эти агенты не дают эффекта де-репрессии, из чего следовало, что инактивация обусловлена не спирализацией хромосомы, а ядерными протеинами.

Такой вывод покоится на том основании, что в опытах автора, несмотря на уменьшение в культуре числа фибробластов, имеющих половой хроматин, каждый клон гетерозиготных клеток обнаруживал присутствие только одного из вариантов энзима Г6ФД (А или В).

Гипотезу Лайон подвергает критическому анализу Griineberg (1966, 1967). Изучив эффект сцепленных с полом генов, он делает вывод, что гипотеза Лайон отвергается на многоклеточном и частично подтверждается на клеточном уровне. Выделив из известных 60 генов человека, сцепленных с полом, 26 генов с доказанной гетерозиготностью, он подразделил их на три группы. В первую группу (17 генов, например, дальтонизма) вошли гены, для которых известен лишь большой (многоклеточный) эффект; во вторую - 4 гена с гуморальной проявляемостью (гемофилия и др.); в третью - 5 генов, действие которых прослеживается на клеточном уровне (например, дефицит энзима Г6ФД и др.).

Мы не имеем возможности подробно остановиться на этой работе, однако отметим, что не всегда позиция автора представляется достаточно обоснованной. Отклонения фенотипа (на многоклеточном уровне) от того, который можно было бы предсказать на основании гипотезы Лайон, могут развиваться в силу многих, еще неясных причин. Lion (1961) отмечает, например, что наличие определенного числа нормальных клеток, присутствующих в мозаике с мутантными, может обеспечивать нормальный фенотип; в других случаях в аналогичной ситуации возможна неполная пенетрантность признака у гетерозигот. Такую трактовку можно признать вполне приемлемой. А. А. Нейфах (1965) указывает, что клетки различного генотипа могут обмениваться продуктами своей жизнедеятельности, при этом мутантные клетки приобретают нормальный фенотип. Эти, в частности, соображения необходимо учитывать при оценке эффекта генов на многоклеточном уровне.

Отклонения со стороны фенотипа, противоречащие на первый взгляд гипотезе Лайон, могут стоять в связи с существованием в неактивной Х-хромосоме активно функционирующих локусов (см. главу VI).

Учение о генетической инактивации Х-хромосомы подробно излагается в работах А. Ф. Захарова (1968), Lyon (1966), Ohno (1967) и др.

Кроме гипотезы Лайон, имеется, как уже отмечалось, еще одна, родственная ей гипотеза «фиксированной дифференциации Х-хромосомы», выдвинутая примерно в то же время Grumbach и соавторами (1960, 1962, 1963). Эти авторы защищают те же представления, что и Lyon. Они показали, что содержание энзима Г6ФД в эритроцитах мужчин и женщин лежит в пределах нормы. Это обстоятельство Grumbach и сотрудники рассматривают как веское доказательство учения о «единственной активной Х-хромосоме». Рассматривая инактивацию гетеропикнотических Х-хромосом как механизм «компенсации дозы», они отмечают, что экстрааутосомы в противоположность сверхчисленным половым хромосомам обычно служат причиной сильных фенотипических сдвигов, поскольку они остаются в активном состоянии.

Существенным моментом исследований на мышах, предпринятых Grumbach с соавторами, являются данные о том, что в соматических клетках женского организма гетерохроматинизации, т. е. инактивации, как правило, подвергается структурно измененная Х-хромосома (деления, транслокация аутосомных сегментов)***. Характерно, что в этих случаях величина телец Барра отражает характер структурного нарушения формирующей их Х-хромосомы (уменьшение в случае делеции, увеличение при транслокации)****. Эту закономерность подтвердили Klinger и соавторы (1965), а также Ockey и соавторы (1966).

Очевидная предпочтительная гетерохроматинизация измененной Х-хромосомы, по Grumbach и соавторам (1963), Gartler и Sparkes (1963), может объясняться селекцией клеток, происходящей после того, как во всех эмбриональных клетках произошла гетерохроматинизация одной из Х-хромосом (наугад: в одних клетках отцовской, в других - материнской). В случае транслокации аутосомного элемента на Х-хромосому инактивация последней влечет за собой, как показали некоторые авторы, инактивацию и прикрепившихся аутосомных локусов, В результате возникает несбалансированность генотипа и из-за понижения жизнеспособности клетки с измененной Х-хромосой постепенно элиминируются.

Однако при возникновении трисомии по транслоцированному аутосомному сегменту, наоборот, вполне жизнеспособными могут оказаться как клеточные варианты с инактивированной Х-хромосомой, несущей аутосомный элемент, так и клетки с нормальным набором XX.

Инактивация аберрантной Х-хромосомы, таким образом, может обеспечивать генетическую сбалансированность, при этом состояние анеуплоидности носит лишь кажущийся характер.

Представляет интерес и другое объяснение, которое предлагают Grumbach и соавторы для анализа факта предпочтительной инактивации структурно измененных Х-хромосом. Авторы говорят о так называемой селективной индукции, развивая «модель эписомального фактора».

Некоторый эписомальный фактор в период раннего эмбриогенеза инкорпорируется в Х-хромосому, в ее специальный рецептивный локус (в каждой клетке). Сразу после этого происходит выработка вещества, которое комбинируется с другим неинкорпорированным фактором клетки и инактивируется им. Поэтому другая Х-хромосо-ма теряет возможность перехода в изопикнотическое состояние. На базе этих представлений можно легко понять хорошо известный фактор, заключающийся в том, что в клетках, независимо от общего числа Х-хромосом, всегда присутствует только одна изопикнотическая хромосома, успевающая (в ранних эмбриональных клетках) первой захватить гипотетический эписомальный фактор.

Grumbach и соавторы допускают еще, что Х-хромосома, лишившаяся эписомального фактора, начинает продуцировать вещество, репрессирующее синтез молекул РНК на ДНК (типа актиномицина D) и способное как-то тормозить способность ДНК к репликации (что соответствует явлению запаздывания гетероциклической Х-хромосомы в митотическом цикле).

Роль эписомального фактора, таким образом, сводится к предупреждению образования вещества репрессора в Х-хромосоме, которая должна остаться в активном состоянии. Эта схема хорошо объясняет факт предпочтительной гетерохроматинизации Х-хромосомы, имеющей делецию (утрата рецептивного локуса, захватывающего эписомальный фактор), но не может удовлетворительно трактовать это явление, если имеется Х-хромосома с транслоцированным аутосомным участком. Evans и соавторы (1965) не подтвердили факта предпочтительной гетерохроматинизации структурно измененной Х-хромосомы (Х-аутосомная транслокация) в клетках у мышей.

* Villaescusa (1967) обнаружил, что 10-29% таких высокоплоидных клеток, как мегакариобласты и мегакариоциты костного мозга и селезенки самцов крыс, содержат тельца Барра.
** Ауторадиографический анализ кариологических данных, полученных на лейкоцитах мула, подтверждает это положение (Mukherjee, Sinha, 1964).
*** Grumbach и соавторы ссылаются на работу Ohno (1962), который не нашел такой предпочтительной гетерохроматинизации структурно измененной Х-хромосомы в клетках у мышей.
**** Taft и соавторы (1965) нашли, что при кариотипе XX площадь тельца полового хроматина ядер буккальных клеток составляет 0,70-0,84 µ 2 , при делении длинного плеча Х-хромосомы - 0,34 µ 2 , а при наличии изохромосомы-Х-0,89-0,97 µ 2 .

Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих

Основное генетическое различие между полами заключается в наличии разного числа Х-хромосом - одна Х-хромосома у самцов и две у самок. Для того, чтобы компенсировать лишнюю дозу гена, у самок происходит инактивация Х-хромосомы. В раннем эмбриогенезе в эпибласте полностью инактивируется одна из Х-хромосом. Она конденсируется, переходя в неактивное состояние, превращаясь в тельце Барра (рис.1). Процесс инактивации Х-хромосомы называется дозовой компенсацией.

рис.1 Клеточное ядро самки с тельцем Барра - конденсированная Х-хромосома на фоне деконденсированных хромосом в интерфазе

Имеется два вида инактивации - специфическая, когда инактивируется определенная Х-хромосома, например только отцовская Х-хромосома у сумчатых (кенгуру), и случайная, когда выбор того, какая Х-хромосома будет инактивирована случаен (плацентарные млекопитающие). Хотя во внезародышевых органах плацентарных также происходит специфическая инактивация.
Центром инактивации является участок Х-хромосомы, называемый Xic (рис.2, 3), имеющий длину по разным данным 35, 80 тпн, или даже больше, что зависит от рассматривания прилежащих последовательностей, участвующих в регуляции инактивации. Xic содержит, как минимум, Xist - ген, кодирующий нетранслируемую RNA, Tsix - антисмысловой локус, содержащий различно метилируемый минисателлитный маркер DXPas34. Так же, очевидно, в формировании Xic участвует последовательность на 3" конце Xist. Вероятно, что другие регулирующие последовательности лежат дальше 3" конца гена Xist. Один из таких регуляторов содержит Xce локус, открытый как модификатор выбора Х-хромосомной инактивации.

рис. 2 (A) На рисунке показаны основные элементы инактивирующего центра, гены Xist и антисмысловой ген Tsix, соседние гены Tsx, Brx и Cdx. Предполагаемые участки, ответственные за выбор (красн.), счет дозы хромосом (желт.), и Xce (син.). Предполагаемые участки 35 kb и 80 kb мышиного Xic. (B) Этапы инактивации Х-хромосомы.

рис.3 Транскрипционная карта Xic района у мыши и человека. Показано 11 генов мышиного Xic района: Xpct, Xist, Tsx, Tsix, Chic1, Cdx4, NapIl2, Cnbp2, Ftx, Jpx и Ppnx. Гены, кодирующие белки, показаны желтым. РНК четырех из 11 генов Xist, Tsix, Ftx и Jpx нетранслируются, показаны красным. Гены, обнаруженные у мышей и человека, консервативны, кроме Ppnx и Tsix. Tsx у человека стал псевдогеном. Человеческий Xic длиннее мышиного примерно в три раза. Не смотря на такую разницу в размерах, расположение и ориентация генов одинакова. Исключением является Xpct, который имеет одинаковое положение, но инвертированную ориентацию. Места диметилирования лизина 9 в гистоне H3 и гиперацетилирования H4 показаны синим и зеленым под транскрипционной картой. Отдельно показаны минимальный промотор гена Xist, занимающий позицию -81- +1, и регуляторный элемент - сайленсер.

Инактивация разделяется на стадии: определение дозы, выбор, инициация, устанавливание и поддержание. Эти процессы являются генетически различными и все они, кроме поддержания, контролируются Xic.
Во время счета дозы клетка определяет число Х-хромосом относительно числа аутосом. Помимо локусов на аутосомах в этом этапе принимает участие участок за 3" конце Xist.
Во время выбора происходит определение того, какая из двух Х хромосом будет инактивирована. В этом процессе принимает участие последовательности в пределах Xist, Tsix и Xce.

Выбор того, какая Х-хромосома инактивируется, случаен, но это может регулироваться аллелями Xce (X-linced X controlling element). В различных мышиных линиях было обнаружено три таких аллеля - слабый Xcea, промежуточный Xceb и сильный Xcec. В гетерозиготах наиболее часто инактивируются те, которые несут более слабый аллель. Например, степень инактивации у гетерозигот Xcea/Xcec приблизительно 25:75. У гомозигот выбор происходит случайно. Xce локус расположен вблизи Xic. Предполагается, что Xce связывают транс-факторы, регулирующие работу генов в Xic, предопределяя выбор между Х-хромосомами. Инактивацию Х-хромосом можно увидеть, используя мышей с мутацией по гену окраски шерсти (например brindled ) на одной Х-хромосоме и нормальный ген на другой. Клетки дикого типа дают черный цвет, а мутантные белый. (рис.4)

рис.4 Визуализация инактивации определенной Х хромосомы.

В недифференцированных клетках изначально гены Xist и Tsix экспрессируются одновременно на каждой Х-хромосоме. Но позже на одной из Х-хромосом репрессируется ген Tsix, что ведет к увеличению уровня экспрессии Xist. РНК Xist присоединяет различные белки, образуя комплексы, которые распределяются вдоль всей Х-хромосомы, запуская ее инактивацию. На другой хромосоме не происходит репрессии гена Tsix и его антисмысловая РНК связывает РНК Xist, блокируя ее накопление (рис.5). Такая хромосома останется в активном состоянии. РНК гена Xist не способна переходить с одной Х-хромосомы на другую.

Рис.5 Модель работы Tsix. (A) Во время транскрипции Tsix блокируется транскрипция Xist. (B) Транскрипция Xist подавлятеся антисмысловой ориентацией RNA-полимеразы и всего транскрипционного комплекса. (С) Сайты, к которыми присоединяются РНК Xist-связывающие белки, могут блокироваться слиянием смысловой и антисмысловой РНК. (D) Появление нестабильного комплекса слившихся смысловой и антисмысловой РНК.

На более поздних этапах происходит замена H2A гистона его аналогом macro H2A (см. обзор Гистоны) и метилирование H3K27, участие различных транс-факторов, CpG метилирование ДНК в промоторах. В конечном итоге происходит установление гетерохроматина по общей концепции (см. обзор Гетерохроматин). Поддержание инактивации.
Инициация инактивации контролируется эксперссией Xist и, однажды установившись, инактивированное состояние больше не зависит от Xic и Xist. На гибридах человеческих и мышиных клеток показвно, что при делеции гена Xist человеческая Х-хромосома поддерживает инактивированное состояние, что указывает на независимое от Xist поддержание инактивации Х-хромосомы. Хотя присутствие Xist после установления инактивации стабилизирует ее.

Инактивация Х-хромосомы у Drosophila

Сокращения:
Xic - Х inactivation centre -Центр инактивации Х-хромосомы.
Xi -X inactive - инактивируемая Х хромосома.
Xa - X-active - активируемая Х хромосома.